发现病毒性心肌炎新靶点的途径——酶切割炎症小体
心肌炎的治疗方案目前有限。抑制钙激活酶已被证明可以预防CVB3诱导的心脏损伤，但钙激活酶的潜在作用机制尚未阐明。本研究证明CVB3感染诱导钙离子依赖的中性蛋白酶-I 1在线粒体中积累，并导致随后的ATP5A1裂解、线粒体ROS过量产生和线粒体功能受损，最终引起NLRP3炎症小体活化并诱导细胞焦亡。本发现确立calpain在病毒性心肌炎中的作用，并揭示其潜在的作用机制。因此，calpain有望成为治疗病毒性心肌炎的新靶点。
技术路线：
主要研究结果：
1、MCC950抑制CVB3诱导的凋亡和炎症反应，保护心肌功能
作者首先探讨直接抑制NLRP3炎症小体在心肌炎中的作用。在柯萨奇病毒B3（CVB3）感染前给予NLRP3选择性抑制剂MCC950后，NLRP3、Gasdermin D N端结构域（Gasdermin D-NT）和cleaved caspase-1（c-caspase-1）蛋白水平降低（图1A）。与CVB3单独感染小鼠相比，MCC950和CVB3共同感染小鼠心脏组织中c-caspase-1的免疫荧光密度降低，与WB结果一致（图1B）。重要的是，给予MCC950后，NLRP3与ASC的共定位明显被抑制，提示NLRP3炎症小体的平台形成减少（图1C）。ELISA检测细胞焦亡情况，结果显示CVB3刺激后血清CK-MB、LDH、cTnI、IL-18、IL-18β水平升高，而MCC950处理后可逆转上述效应（图1D-H）。此外，CVB3感染诱导的CD4阳性T淋巴细胞和F4/80阳性巨噬细胞浸润在CVB3 + MCC950组中不明显（图1I）。此外，与CVB3组相比，CVB3 + MCC950组通过降低射血分数（EF）和短轴缩短率（FS）显著改善心功能（图1J）。此外，CVB3 + MCC950组的心肌细胞存活率高于CVB3组，表明MCC950介导的抑制NLRP3炎症小体活化减轻CVB3诱导的死亡（图1K）。因此，MCC950能抑制CVB3诱导的凋亡和炎症反应，保护心肌功能。
图1 腹腔注射CVB3建立小鼠心肌炎模型
2、Calpastatin过表达抑制CVB3诱导的细胞凋亡、纤维化和炎症，改善心功能障碍
接下来揭示calpain在CVB3诱导的心肌炎中潜在作用机制。如图2A所示，在CVB3注射后第7天，WT + CVB3组145/150 kDa处的α-Fodrin显著增加，而Tg-CAST + CVB3组α-Fodrin显著减少，提示calpastatin过表达对calpain活化的抑制作用。TUNEL染色显示WT + CVB3组TUNEL阳性细胞数较Tg-CAST + CVB3组增多（图2B）。HE染色结果显示，与WT + CVB3组相比，calpastatin过表达抑制CVB3诱导的炎症反应，Tg-CAST + CVB3组可见较少的炎性细胞浸润和坏死灶（图2C）。与WT小鼠相比，CVB3感染后Tg-CAST小鼠心脏组织中CD4 + T淋巴细胞和F4/80 +巨噬细胞浸润减少（图2D）。这说明长期CVB3感染导致心脏纤维化和心功能障碍。心脏组织切片的Masson染色显示，CVB3感染后100个月，WT小鼠心脏纤维化显著增加，而Tg-CAST小鼠心脏纤维化无明显变化（图2E）。CVB3感染导致WT小鼠出现明显的心功能障碍，表现为左心室EF和FS降低，而过表达calpastatin的Tg-CAST小鼠心功能显著改善（图2F）。因此，在体内抑制calpain不仅在急性期保护小鼠心脏免受CVB3感染诱导的细胞凋亡和炎症反应，而且在长期保护小鼠心脏免受心脏纤维化和心功能障碍。
图2 在calpastatin过表达小鼠（Tg-CAST）及其同窝野生型小鼠（WT）中构建CVB3诱导的心肌炎模型
3、calpastatin过表达抑制CVB3感染后NLRP3炎症小体和细胞焦亡
接下来，作者确定calpain是否在NLRP3炎症小体的激活中发挥作用。在CVB3感染后，与WT小鼠相比，Tg-CAST小鼠的NLRP3、gasdermin D-NT和c-caspase-1水平显著降低（图3A）。免疫荧光染色也显示，在Tg CAST + CVB3组中过表达calpastatin抑制c-caspase-1、ASC、NLRP3的表达以及ASC与NLRP3的共定位（图3B-C）。此外，Tg-CAST + CVB3组血清CK-MB、LDH、cTnI、IL-18和IL-1 β水平较低，表明细胞焦亡较少（图3D-H）。为验证在体内的发现，并确定钙离子依赖的中性蛋白酶-I1是否是CVB3诱导的心肌炎中的主要钙蛋白酶，用钙离子依赖的中性蛋白酶-I1选择性抑制剂PD151746处理乳鼠心肌细胞后降低145/150 kDa处α-Fodrin的水平，证实钙激活酶的激活被PD151746显著抑制（图3I）。此外，PD151746处理抑制CVB3感染后心肌细胞中NLRP3、Gasdermin D-NT和c-caspase-1水平升高（图3I）。此外，PD151746保护心肌细胞免受CVB3诱导的细胞死亡（图3J）。这些发现证实钙离子依赖的中性蛋白酶-I 1是CVB3诱导的心肌炎中主要的钙蛋白酶。总之，体内和体外实验的结果提示，在CVB3感染的环境中抑制钙激活酶的激活可以阻断NLRP3炎症小体的激活，抑制细胞焦亡。
图3 CVB3感染的Tg-CAST和WT小鼠NLRP3炎症小体活化和细胞焦亡
4、mito-TEMPO预防炎症，抑制NLRP3炎症小体，改善心脏功能
下面进一步研究CVB3对病毒心肌组织发育过程中线粒体功能的影响。HE染色显示，CVB3感染后第3天，几乎看不到浸润的炎性细胞和坏死灶，但在CVB3感染后第7天，心肌出现严重的心脏炎症和损伤（图4A）。透射电镜观察发现，CVB3感染后第3天开始出现线粒体形态的改变。线粒体肿胀，排列不规则，内含不规则排列的嵴，嵴异常，空泡增多（图4A）。因此，在炎症反应之前出现异常线粒体，表明线粒体功能障碍可能导致CVB3诱导的心肌炎炎症。在CVB3感染前腹腔注射线粒体靶向抗氧化剂（mito-TEMPO）的小鼠，可降低CVB3诱导的线粒体活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平（图4B）。CVB3感染诱导的CD4阳性T淋巴细胞和F4/80阳性巨噬细胞的浸润也被mito-TEMPO阻断（图4C）。重要的是，mito-TEMPO改善心脏功能，表现为增强的EF值和FS值（图4D）。线粒体ROS能否作为NLRP3炎症小体激活的原因。mito-TEMPO处理不仅降低CVB3诱导的Gasdermin D-NT和c-caspase-1水平的升高（图4E），而且降低血清CK-MB、LDH、IL-18和IL-1 β水平的升高（图4F-J）。总之，这些结果表明在CVB3诱导的心肌炎中，线粒体ROS与NLRP3炎症小体活化之间存在关联。
图4 mito-TEMPO预防炎症，抑制NLRP3炎症小体，改善心脏功能
5、Calpain-1调节线粒体功能，mito-TEMPO逆转calpain-1介导的NLRP3炎症小体活化
作者检测calpain在CVB3诱导的心肌炎中线粒体功能障碍与炎症反应中的作用。透射电镜显示，第3天起，与WT + CVB3组相比，过表达calpastatin的Tg-CAST + CVB3组线粒体结构损伤减轻，线粒体排列整齐，嵴排列较规则，空泡较少（图5A）。此外，如图所示，CVB3感染显著降低心肌ATP生成，而calpastatin过表达逆转受损的ATP生成，尽管并不显著（图5B）。此外，与WT + CVB3组相比，Tg-CAST + CVB3组心脏ROS染色不明显（图5C）。以上结果提示体内抑制calpain活性时线粒体功能更好。此外，JC-1染色检测线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，Δψm）结果显示CVB3感染导致Δψm降低，表现为较高的绿/红荧光比值，而PD151746单独处理并不影响Δψm，但PD151746处理可以阻止CVB3感染时Δψm的丢失（图5D）。此外，CVB3感染降低心肌细胞ATP生成，但PD151746处理在CVB3感染时一定程度上保留ATP生成（图5E）。接下来，作者使用MitoSOX Red探针检测线粒体氧化应激。如图5F所示，CVB3增加心肌细胞线粒体ROS生成，PD151746可抑制CVB3诱导的线粒体ROS生成。为直接地检测Calapin-1在心肌细胞中的作用，用带有Flag标签的过表达钙离子依赖的中性蛋白酶-I腺病毒（Ad-CAPN1）感染原代心肌细胞。Ad-CAPN1显著上调Flag表达，表明具有较高的感染效率（图5G）。心肌细胞用Ad-CAPN1或对照腺病毒（Ad-CT）处理48 h后感染CVB3，或Ad-CT感染的心肌细胞用CVB3和PD151746处理，然后用XFe96细胞外流量分析仪测定耗氧率（OCR）。CVB3处理下线粒体的基础呼吸、ATP连接的呼吸和最大呼吸均受到抑制，而钙离子依赖的中性蛋白酶-I1过表达并感染Ad-CAPN1进一步加剧这些效应。相反，PD151746缓解CVB3损伤的线粒体呼吸（图5H-K）。此外，钙离子依赖的中性蛋白酶-I1过表达加重CVB3诱导的细胞死亡，而mito-TEMPO保留细胞活性（图5L）。同样，CVB3处理后，mito-TEMPO孵育后钙离子依赖的中性蛋白酶-I1过表达增强的Gasdermin D-NT和c-caspase-1蛋白水平降低（图5M）。综上所述，钙离子依赖的中性蛋白酶-I1通过线粒体ROS介导的NLRP3炎症小体活化调节CVB3处理下的线粒体功能。
图5 calpain-1调节线粒体功能，mito-TEMPO逆转calpain-1介导的NLRP3炎症小体活化
6、CVB3刺激后calpain‑1在线粒体中积累
钙离子依赖的中性蛋白酶-I 1在心肌细胞中的具体作用靶点尚不清楚，作者评估CVB3感染下钙离子依赖的中性蛋白酶-I 1在心肌细胞中的胞浆和线粒体定位。在心脏组织中分离胞浆和线粒体组分，然后检测钙离子依赖的中性蛋白酶-I 1的蛋白水平。GAPDH的缺失和VDAC1的富集证实线粒体的纯度，CVB3感染的心脏中线粒体钙离子依赖的中性蛋白酶-I 1与胞浆钙离子依赖的中性蛋白酶-I 1的比值显著升高（图6A）。与体内研究结果一致，免疫荧光染色显示CVB3感染促进体外培养的心肌细胞中钙离子依赖的中性蛋白酶-I 1与线粒体的共定位（图6B），且CVB3感染后钙离子依赖的中性蛋白酶-I 1在线粒体中的蛋白水平高于细胞质（图6C）。因此，在CVB3感染下，细胞内钙离子依赖的中性蛋白酶-I 1的重新分布可能有助于其作用的发挥。然后，钙离子依赖的中性蛋白酶-I 1过表达仅限于线粒体（图6D）。在线粒体中过表达钙离子依赖的中性蛋白酶-I 1导致AC16细胞活力降低，该作用可被mito-TEMPO阻断（图6E）。此外，过表达线粒体钙离子依赖的中性蛋白酶-I 1增加gasdermin D-NT和c-caspase-1的蛋白水平，而mito-TEMPO抑制gasdermin D-NT和c-caspase-1的蛋白水平（图6F）。总之，数据表明CVB3刺激后钙离子依赖的中性蛋白酶-I 1的细胞质到线粒体的转位负责其对细胞活力和NLRP3炎症小体活化的调节。
图6 CVB3刺激后Calpain-1在线粒体中积累
为进一步探索CVB3感染下钙离子依赖的中性蛋白酶-I-1在心肌细胞中的直接作用靶点，作者用Ad-CAPN1在新生大鼠心肌细胞中过表达calpain-1，然后在CVB3感染或不感染的情况下，将提取的蛋白与抗Flag抗体或对照抗IgG抗体进行免疫共沉淀并进行质谱分析。筛选出假阳性蛋白，即抗Flag抗体免疫沉淀的蛋白与相应对照的重叠蛋白，在Ad-CAPN1感染的细胞中，有8个蛋白被抗Flag抗体免疫沉淀，有或没有CVB3处理（图7A）。因此，作者检测WT + CVB3组和Tg-CAST + CVB3组中ATP synthase-α（ATP5A1）的表达。研究发现CVB3感染降低WT小鼠ATP5A1的表达，但在Tg-CAST小鼠中没有发现（图7B），这表明CVB3感染激活的calpain可能切割ATP5A1，导致功能性ATP5A1蛋白水平降低。体外实验结果也显示CVB3感染降低ATP5A1水平，而PD151746共处理逆转的这一现象（图7C）。此外，CVB3处理NRCMs后，在抗钙离子依赖的中性蛋白酶-I 1抗体免疫沉淀样品中检测到ATP5A1的表达，在抗ATP5A1抗体免疫沉淀样品中检测到钙离子依赖的中性蛋白酶-I 1的表达，OV07 1与NRCMs中的ATP5A1存在相互作用（图7D-E）。将siATP5A1转染NRCMs敲低ATP5A1表达（图7I），JC-1染色和MitoSOX染色发现siATP5A1降低线粒体Δψm，增加线粒体ROS（图7F）。ATP5A1下调也降低ATP的生成（图7G）。此外，与对照siRNA相比，siATP5A1降低NRCMs的活力（图7H），促进NLRP3炎症小体的激活，表现为gasdermin D-NT和c-caspase-1的水平升高（图7I）。因此，ATP5A1是钙蛋白酶-1的切割靶点。
图7 ATP5A1是钙蛋白酶-1的切割靶点
结论
在本研究中，作者证明体内外抑制calpain通过抑制NLRP3炎症小体的激活减轻CVB3诱导的心肌损伤。此外，作者发现CVB3处理下钙离子依赖的中性蛋白酶-I 1的作用改变线粒体功能，因为钙离子依赖的中性蛋白酶-I 1易位到线粒体并切割ATP5A1，导致ATP合成不足，线粒体ROS过量产生，线粒体功能障碍，随后激活NLRP3炎症小体和细胞焦亡（图8）。
图8在CVB3刺激下激活的Calpain-1通过线粒体中ATP5A1的裂解和ROS的过量产生促进NLRP3炎性体依赖性的焦亡
参考文献
Liu X, Li M, Chen Z, Yu Y, Shi H, Yu Y, Wang Y, Chen R, Ge J. 2022. Mitochondrial calpain-1 activates NLRP3 inflammasome by cleaving ATP5A1 and inducing mitochondrial ROS in CVB3-induced myocarditis. Basic Res Cardiol; 117(1):40. doi: 10.1007/s00395-022-00948-1.