外泌体miR-140-5p通过靶向IGF1R和调节后纵韧带骨化过程中的mTOR通路抑制成骨

后纵韧带骨化(OPLL)是一种致残性疾病，其发病机制尚不清楚，尚无有效的治疗或预防方法。外泌体miRNA在异位骨的成骨过程中起着重要作用。最近，有作者关注miR-140-5p在OPLL细胞来源外泌体中的下调，因此以探索外泌体miR-140-5p抑制OPLL成骨的机制。该研究于2022年10月发表在《Journal of Nanobiotechnology》，IF：9.249.

技术路线：

主要研究结果：

1. MiR-140-5p在来自OPLL细胞的外泌体中显著下调

作者在手术过程中收集OPLL患者的组织样本，利用靠近骨化块的韧带体外培养细胞，并在后纵韧带细胞培养上清中收集外泌体。以从颈椎外伤(non-OPLL)患者的后纵韧带(PLL)细胞培养上清中获得外泌体作为对照组。在透射电镜下观察到典型的外泌体双层膜结构(图1a)。纳米颗粒跟踪分析(NTA)显示各组收集到的胞外囊泡大小约为108 nm至120 nm(图1b)。检测到外泌体标记CD63和TSG101(图1c)。随后，使用下一代测序(NGS)技术分析外泌体中差异表达的miRNAs(图1d)。用PCR检测前三种下调的miRNA以验证NGS数据，结果显示miR-140-5p在OPLL细胞来源的外泌体中显著下调(图1e)。

图1 MiR-140-5p在来自OPLL细胞的外泌体中显著下调

2. 外泌体miR-140-5p从OPLL细胞传递到hMSCs

为了阐明miR-140-5p是否由OPLL细胞分泌并传递到hMSCs，用慢病毒(LV-miR-140-5p)或其阴性对照转染OPLL细胞，使miR-140-5p过表达(图2a)，然后收集细胞培养上清分离外泌体。qPCR显示miR-140-5p在外泌体中富集(图2b)。用PKH67标记过表达miR-140-5p的外泌体，然后将其添加到hMSC培养中。在hMSCs的细胞质中PKH67荧光呈阳性(图2c)，表明miR-140-5p通过外泌体传递到hMSCs中。此外，在用过表达miR-140-5p的外泌体和对照外泌体培养的hMSCs中，分析miR-140-5p的前体miR-140的表达水平(图2d)，均无显著差异。这些结果表明，miR-140-5p在hMSCs中的上调是由外泌体传递而非内源性miR-140转录诱导的。

图2外泌体miR-140-5p从后纵韧带细胞传递到hMSCs

3. MiR-140-5p抑制hMSCs成骨分化

形成异位骨化的前提是hMSCs开始成骨分化。因此，为了阐明外泌体miR-140-5p在OPLL发病机制中的作用，研究外泌体miR-140-5p对hMSCs成骨分化的影响。用慢病毒LV-miR-140-5p或LV-sponge分别转染OPLL细胞(图3a)，使miR-140-5p过表达或下调；同时转染阴性对照慢病毒LV-miR-NC或LV-sponge-NC。随后，收集细胞条件培养基分离以下外泌体：miR-140-5p-exo, miR-NC-exo, sponge-exo和sponge-NC-exo。qPCR证实miR-140-5p在外泌体中成功过表达或下调(图3b)。hMSC与上述外泌体培养24 h后，qPCR显示miR-140-5p-exo处理后，miR-140-5p在hMSCs中的表达上调(图3c)，说明miR-140-5p通过外泌体传递到hMSCs中。随后使用成骨诱导培养基诱导hMSCs成骨分化。7天后，用alkaline phosphatase对hMSCs进行染色。14 d后，用Alizarin red染色hMSCs。结果显示，miR-140-5p-exo处理后hMSC染色阳性率明显低于其他各组(图3d，e)。qPCR和Western blotting显示，在miR-140-5p-exo处理的hMSCs中，成骨相关基因的表达被显著抑制(图3f，g)。综上所述，这些结果表明外泌体miR-140-5p抑制了hMSCs的成骨分化。外泌体中miR-140-5p的缺失可促进hMSCs成骨分化和成骨相关基因的表达。

图3 MiR-140-5p抑制hMSCs成骨分化

4. 胰岛素样生长因子1 (IGF1R)是miR-140-5p的直接靶标

为了阐明miR-140-5p抑制hMSCs成骨分化的机制，使用TargetScan数据库预测了miR-140-5p的靶基因，发现了434个转录本。使用miRDB数据库预测靶点，miRDB中有413个miR-140-5p预测靶点。为了缩小可能的候选基因范围，我们测定了上述两个数据库的重叠，共显示191个基因(图4a)。其中一种是IGF1R，它属于受体酪氨酸激酶家族。我们检测了miR-140-5p-exo处理后hMSCs中IGF1R的mRNA水平，结果显示IGF1R的mRNA水平明显降低(图4b)。荧光素酶报告实验证明IGF1R与miR-140-5p能直接结合(图4c，d)。此外， miR-140-5p mimic下调了hMSCs中IGF1R mRNA和IGF1R蛋白(图4e, f)。综上所述，这些结果表明IGF1R是miR-140-5p的直接靶标。外泌体miR-140-5p与IGF1R 3'UTR相互作用，并在hMSCs中发挥转录抑制作用。

图4 IGF1R是miR-140-5p的直接靶标

5. 来源于OPLL细胞的外泌体miR-140-5p靶向IGF1R并调节mTOR通路

为了阐明外泌体miR-140-5p对hMSCs成骨分化的抑制作用是通过抑制IGF1R介导的，使用IGF1R siRNA直接敲除hMSCs中的IGF1R(图5a)。hMSCs成骨诱导后，敲低组hMSCs alkaline phosphatase和Alizarin red染色阳性率明显低于对照组(图5b, c)。OCN、COLIA1、RUNX2和ALP的表达也被抑制(图5d，e)。IGF1R拯救实验表明，上调IGF1R后，alkaline phosphatase和Alizarin red染色呈强阳性，OCN、COLIA1、RUNX2、ALP表达水平也升高(图5f-j)。此外，在用LV-IGF1R转染hMSCs后，用miR-140-5p-exo处理，IGF1R促进成骨的作用被逆转(图5k, l)。

图5 IGF1R对于外泌体miR-140-5p抑制hMSCs成骨至关重要

有文献报道IGF1和IGF1R联合使用可以通过激活mTOR通路促进MSCs成骨，从而改善小鼠骨质疏松症。在用miR-140-5p-exo处理hMSCs后，IGF1不刺激IGF1R、IRS1、PI3K、Akt或mTOR的磷酸化，而在miR-NC-exo、sponge-exo或sponge-NC-exo处理后，IGF1刺激IGF1R、IRS1、PI3K、Akt和mTOR的磷酸化(图6a)。为了阐明IRS1、PI3K、Akt和mTOR的上下行关系，用IRS1抑制剂NT157处理hMSCs。结果表明，IGF1不能引起PI3K、Akt、mTOR的磷酸化。LY294002 (PI3K抑制剂)治疗可降低IGF1引起的Akt和mTOR磷酸化，但不影响IGF1R和IRS1的磷酸化。此外，MHY1485 (mTOR抑制剂)治疗不能抑制IGF1引起的IRS1、PI3K或Akt的磷酸化(图6b)。因此，上述关键分子的上下行关系为IGF1R/IRS1/PI3K/Akt/mTOR。为了进一步阐明IGF1R/IRS1/PI3K/Akt/mTOR轴的作用，分别使用NT157 (IRS1抑制剂)、LY294002 (PI3K抑制剂)、MK2206 (Akt抑制剂)和MHY1485 (mTOR抑制剂)干扰hMSCs的成骨诱导。结果显示NT157、LY294002、MK2206、MHY1485分别抑制hMSCs的成骨分化(图6c, d)。综上所述，这些数据表明外泌体miR-140-5p通过靶向IGF1R和调节mTOR途径抑制hMSCs的成骨分化。

图6外泌体miR-140-5p通过IGF1R/IRS1/PI3K/Akt轴调控mTOR通路抑制成骨

6. MiR-140-5p在体内抑制骨形成

为了进一步探索miR-140-5p在体内的功能，在裸鼠中进行了异位骨形成实验。用miR-140-5p-exo、miR-NC-exo、sponge-exo或sponge-NC-exo培养hMSCs 48 h。成骨诱导后，将上述hMSCs与Bio-Oss Collagen充分混合并培养48 h。最后，将支架和细胞的混合物植入裸鼠背部皮肤下(图7a)。8周后处死动物，通过显微计算机断层扫描计算骨体积/组织体积(BV/TV)和骨密度(BMD)(图7b)。结果显示，miR-140-5p-exo处理后，异位骨BV/TV和BMD显著降低(图7c和d)。随后，对异位骨进行免疫组化检测，结果显示miR-140-5p-exo处理后，异位骨中OCN、COLIA1、RUNX2、ALP的表达均被抑制，而对照组均为阳性(图7e)。此外，还对异位骨切片进行IGF1R免疫染色，结果显示，miR-140-5p-exo处理的异位骨中IGF1R阳性率明显低于对照组(图7e)。上述结果表明，miR-140-5p在体内对骨形成具有抑制作用。

综上所述，外泌体miR-140-5p在PLL细胞中的表达明显低于PLL细胞。MiR-140-5p通过外泌体转入hMSCs，靶向IGF1R，调控IRS1/PI3K/Akt，最终通过mTOR途径抑制成骨分化（图7f）。在OPLL细胞中过表达miR-140-5p可抑制hMSCs的成骨分化，这是一种潜在的治疗OPLL的新策略。

图7 MiR-140-5p在体内抑制骨形成

结论：

外泌体miR-140-5p可以通过靶向IGF1R和调节mTOR途径抑制hMSCs的成骨分化。外泌体作为一种药物传递系统，可能在未来成为治疗OPLL的潜在药物治疗手段。IGF1B也可能是未来OPLL分子治疗的靶点。

参考文献：

Tang Y, Sun Y, Zeng J, Yuan B, Zhao Y, Geng X, Jia L, Zhou S, Chen X. Exosomal miR-140-5p inhibits osteogenesis by targeting IGF1R and regulating the mTOR pathway in ossification of the posterior longitudinal ligament. J Nanobiotechnology. 2022;20(1):452.