基于全转录组测序分析淋巴转移相关circRNA-miRNA-mRNA网络探索三阴性乳腺癌的发病机制和治疗靶点

三阴性乳腺癌（TNBC）约占全球乳腺癌诊断总发病率的15%，预后相对不利。对于TNBC患者，局部或区域复发、远处转移和死亡的风险在诊断后约2-3年达到高峰，TNBC似乎更可能转移到内脏器官，如肝、肺和脑。特别是，TNBC患者的腋窝淋巴结（ALNs）转移是一个强有力的独立预后因素，表明5年生存率较差。此外，与淋巴结阴性患者相比，微转移淋巴结受累与死亡风险增加相关。然而，ALN转移的潜在确切机制尚不清楚。该研究发表于《Journal of Translational Medicine》，IF: 8.44。

技术路线：

主要研究结果：

首先，为了鉴定潜在的ALN转移相关miRNA、circRNA和mRNA，对三对ALN阳性和ALN阴性TNBC组织进行了全转录组测序（WTS）。作者总共鉴定了739个mRNA，206个circRNA和110个miRNA，它们以热图的形式呈现（图1）。

图1 ALN阳性和ALN阴性TNBC患者之间差异表达RNA的热图

简而言之，鉴定出206个DEC，包括41个上调和165个下调的circRNA（图2A）。共鉴定出110个DEMi，其中53个上调miRNA和57个下调miRNA（图2B）。同时，在739个DEM中，371个mRNA过表达，368个mRNA下调（图2C）。

图2 ALN阳性和ALN阴性TNBC患者之间差异表达RNA的火山图

然后，对DEM进行了功能富集分析。通过clusterProfiler（版本3.14.3）进行KEGG通路分析以识别显著富集的通路。具体而言，DEMs主要富集于TGF-β信号通路、药物代谢-细胞色素P450通路、细胞周期、p53信号通路、乳腺癌、TNF信号通路、IL-17信号通路和河马信号通路（图3A）。此外，还进行了标志性基因分析，以使用clusterProfiler基于分子特征数据库确定有意义的途径。DEM主要参与E2F靶标、缺口信号传导、血管生成、G2M检查点、糖酵解、早期雌激素反应、晚期雌激素反应和IL2 STAT5信号传导（图3B）。在这些通路中，TNF信号通路、细胞周期、p53信号通路、乳腺癌和NOTCH信号通路与TNBC的致癌作用和进展有关。

图3 DEM的功能富集分析

接下来，为了探索DEC和DEMis在TNBC的ceRNA网络中的潜在重要作用，作者构建了一个circRNA-miRNA\u2012mRNA（ceRNA）网络。首先，作者提取了从RNA-seq数据中选择的八个排名靠前的DEC（hsa_circRNA_061260，hsa_circRNA_060876，hsa_circRNA_046265，hsa_circRNA_087060，hsa_circRNA_007336，hsa_circRNA_007333，hsa_circRNA_044837和hsa_circRNA_000150）相关的数据。然后，作者使用circBank和CircInteractome在线数据集筛选了八个DEC靶向的潜在miRNA，并将它们与已鉴定的DEMi重叠。结果，产生了由8个DEC和6个DEMi（has-miR-1207-5p，has-miR-4763-3p，has-miR-326，has-miR-885-3p，has-miR-5000-3p和has-miR-4792）组成的circRNA-miRNA网络。随后，利用miRTarBase和TargetScan来识别这6个DEMi靶向的mRNA。接下来，将靶向mRNA与先前确定的DEM进行交叉检查，并识别出18个DEM。最后，作者使用Cytoscape 3.7.1在TNBC中建立了一个包含8个DECs，6个DEMi和18个DEMs的ceRNA调控网络（图4）。

图4 TNBC中circRNA-miRNA-mRNA的ALN转移相关ceRNA网络

下一步是对相关的DEM进行生存分析。为了研究DEMs的表达及其在BC中的预后价值，作者从Kaplan\u2012Meier Plotter数据库中检索了临床样品的mRNA表达谱数据以及相应的总生存期（OS）和无复发生存期（RFS）数据。然后，对来自ceRNA网络的18个DEM进行存活分析。RAB3D和EDARADD与OS显著相关，GSR与BC患者的RFS显著相关（图5）。RAB3D和EDARADD的高表达水平预示着更好的OS。同时，GSR的高表达水平预示着更好的RFS。因此，这3种mRNA及其对应的基因最有可能成为通过TNBC中ceRNA网络调控DEC的靶基因。

图5 ceRNA网络中生存相关差异表达的mRNA的Kaplan\u2012Meier曲线

根据生存相关DEM的结果，作者确定了与生存结果相关的相应基因。三个已鉴定的基因（RAB3D，EDARADD和GSR）可能是TNBC预后的重要生物标志物。然后，作者基于这些th-ree基因构建了一个与生存相关的ceRNA网络。如图6所示，鉴定了包含两个DEC（hsa_circRNA_061260和hsa_circRNA_060876）、两个DEMIS（has-miR-5000-3p 和 has-miR-4792）和三个 mRNA（GSR、RAB3D 和 EDARADD）的三个ceRNA调控轴。来自生存相关ceRNA网络的这些调节模块包括hsa_circRNA_060876 / hsa-miR-4792 / GSR调控轴、hsa_circRNA_060876 / hsa-miR-4792 / RAB3D调控轴和hsa_circRNA_061260 / hsa-miR-5000-3p / EDARADD调控轴。

图6 TNBC中与生存相关的circRNA-miRNA\uu2012mRNA调控网络

最后，为了验证TNBC细胞中可能失调的候选DEC的结果，作者首先在以下细胞系中进行RT\u2012qPCR：MCF-10 A，MDA-MB-231和MDA-MB-453。作者选择了两个DEC进行进一步分析，并进行了Sanger测序，以确认这两个DEC独特的反向拼接连接位点（图7A-B）。DEC hsa_circRNA_061260位于chr21：11，047，480–11，049，621，由外显子4和外显子5组成。DEC hsa_circRNA_060876位于chr20：50，226，639–50，292，747，由外显子10至24组成。PCR结果显示，与MCF-10 A细胞系相比，MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞系中hsa_circRNA_061260和hsa_circRNA_060876的表达水平均下调（p <0.01; 图7C-D）。

图7 有关circRNA及其反向拼接连接位点的详细信息

结论：

该研究利用WTS研究了TNBC中ALN转移的分子机制。建立了生存相关的ceRNA网络，确定了两种新型DEC作为TNBC中ALN转移的可能预后预测因子和潜在治疗靶点。这些发现为阐明TNBCALN转移的机制、实现早期诊断和确定治疗靶点提供了新的思路。

参考文献：

Luo J, Cao D, Hu C, Liang Z, Zhang Y, Lai J. Lymphatic metastasis-associated circRNA‒miRNA‒mRNA network for exploring the pathogenesis and therapeutic target of triple negative breast cancer based on whole-transcriptome sequencing analysis: an experimental verification study. J Transl Med. 2022 Nov 5;20(1):508. doi: 10.1186/s12967-022-03728-6.