树突状细胞功能微调
树突状细胞（DC）微调炎症和耐受性反应以保护免疫病理。然而，共同调节因子在维持这种平衡方面的作用尚未得到探讨。本研究发现NCoR1及其同源物NCoR2（SMRT）可通过调节STAT3信号通路维持DC炎症和耐受性反应平衡。本研究于2022年9月发表在《Frontiers in Immunology》IF：8.786期刊上。
技术路线：
主要实验结果：
1、SMRT KD cDC1 DCs增强激活/共刺激
构建稳定的Ncor2基因敲除（SMRT KD）和空载体对照的cDC1细胞系。敲除效率在mRNA水平和蛋白水平上得到验证（图1A）。然后，用RT-qPCR检测对照组和SMRT KD cDC1细胞在CpG激活前后2小时和6小时促炎因子（Il12b）和抗炎因子（Il10）mRNA的表达。发现，与对照细胞相比，在SMRT KD cDC1中，CpG刺激后Il12b显著增加，Il10表达同时减少（图1A）。此外，流式细胞术分析显示，与对照组相比，SMRT KD cDC1中的阳性细胞比例和共刺激分子(CD80、CD86和CD40)显著增加（图1B）。接下来，通过MHC-II和MHC-I在SMRT KD cDC1中的表达来研究抗原呈递能力。在CpG和pIC激活过程中，MHC-I阳性细胞比例显著增加，而MHC-II水平保持不变（图1）。MHC-II和MHC-I分子的MFI变化也表现出类似的趋势。在CpG刺激18h后，用流式细胞术检测CD80、CD86和MHC-II的表达，发现SMRT KD BMcDC1较对照显著升高，而MHC-I则呈升高趋势（图1C）。
图1 TLR9与CpG-B配对后SMRT缺失的cDC1和BMcDC1的激活和成熟增强
2、SMRT KD cDC1增加促炎因子IL6，IL-12，IL-23而减少IL-10
接下来，检测了cDC1系和原发系BMcDC1中重要的DC反应细胞因子的表达。发现与对照cDC1比较，CpG和pIC处理6h后，SMRT敲除显著增强了阳性细胞的比例和和MFI转变即IL6，IL-12p40，IL-23p19（图2A）。在未受刺激和CpG激活6h的SMRT KD cDC1中IL-23p19均显著升高。相反，与对照组相比，CpG和pIC激活的SMRT KD cDC1上IL-10显著降低（图2A）。为了进一步估计这些细胞因子在CpG激活的cDC1系培养液中的水平，进行了生物复合物检测，发现IL-6、IL-12p40和IL-12p70的分泌水平在SMRT KD cDC1中明显增加，同时IL-10也随之减少（图2B）。与DC中的趋势相似，与对照组相比，在SMRT KD BMcDC1中观察到阳性细胞百分比显著增加，IL-6和IL-23的MFI呈增加趋势，而IL-10的表达减少。然而，在SMRT KD BMcDC1中IL-12p40的阳性细胞及其MFI虽然高于对照组，但并不显著（图2C）。这些结果表明SMRT KD cDC1具有很强的炎症表型。
3、OT-II CD4 + Th细胞与SMRT KD cDC1共培养增强Th1和Th17分化
为了解SMRT缺失cDC1对CD4 + Th细胞增殖和分化的功能影响，从OT-II转基因小鼠脾脏分离纯化的CD4 + T细胞与SMRT KD和对照cDC1细胞进行共培养。分离OT-II T细胞，与OVA脉冲和CpG或pIC激活的DC共培养72h检查增殖，96h检查分化。在增殖实验中，我们用efluor-670增殖染料标记OT-II T细胞。
与对照相比，SMRT KD细胞增强T细胞的增殖（图3A,B）。众所周知，IL-6抑制FOXP3转录因子的表达，从而抑制Treg的分化，并与IL-23一起通过诱导RORgt的表达导致Th17细胞的发育。另一方面，已知IL-12p70上调T-bet导致Th1分化。在OT-II共培养实验中，发现在CpG激活的SMRT KD cDC1组，CD44+ T-bet + IFN-g +和CD44 + RORgt+ IL-17+细胞的比例增加，其表明Th1和Th17亚型频率增强的比例显著高于对照组DC（图3C-F）。为进一步证实Th17极化增加，检测了共培养细胞的上清中IL-17细胞因子的分泌水平，发现其水平显著升高（图3G）。所有的下游分析都在这些双阳性细胞中进行。
图3 SMRT KD cDC1增强了Th1和Th17细胞的体外极化
4、类风湿性关节炎(RA)患者的PBMCs的Ncor2表达降低
RA等自身免疫性疾病被广泛归类为Th1和Th17疾病，IL-10的表达在这些患者中也被发现大幅降低。早前已经证实Th1反应与自身免疫性疾病有关。然而，对IFN-g和IL-12-/-小鼠的研究表明，这些小鼠有很高的概率发展为胶原诱导关节炎。本研究中，已经确定了Th17细胞在自身免疫中的作用。因此，为确定Ncor2的表达是否在自身免疫性疾病中发生改变，对11例RA患者和14例健康供体的PBMCs进行了Ncor2的RT- qPCR，结果发现与健康对照比较，RA患者PBMCs中Ncor2表达显著降低（图3H）。这一结果提示，在RA疾病中Ncor2的降低可能与炎症表型的增加有关。
5、SMRT KD cDC1与OT-I CD8+ T细胞共培养增加T细胞的细胞毒性
由于观察到在SMRT耗尽的cDC1中MHC-I表达显著增加，于是进一步确定这些DC是否有可能增加CD8+ T细胞的细胞毒性。为验证这一点，从OT-I转基因小鼠的脾脏中分离出CD8+ T细胞，并将其与对照组和SMRT KD cDC1共培养。首先用SIINFKL (OVA肽257-264)脉冲DC过夜。脉冲DC被CpG或pIC激活2h后与纯化的CD8+ T细胞共培养。然后检测共培养CD8+ T细胞在72h后的增殖和96h后IFN-g、perforin和颗粒酶B（GrB）的表达。使用eFluor 670标记的CD8+ T细胞进行增殖试验，发现共培养的OT-I CD8+ T细胞增殖未见明显变化（图4A,B）。与对照组相比，CpG激活的SMRT KD cDC1共培养的表达IFN-g、perforin和GrB的CD8+ CD44+ T细胞阳性率显著上调（图4C）。
图4 SMRT KD cDC1增加了CD8 T淋巴细胞体外perforin，granzyme和IFN-g的产生
6、过继转移CpG脉冲SMRT缺失的cDC1后，OVA诱导的迟发性超敏（OVA- DTH）小鼠足垫炎症增强，并且降低小鼠B16F10黑色素瘤负担
建立OVA- DTH小鼠模型，以研究对照和SMRT KD cDC1 DCs的免疫调节。首先在小鼠耳后皮下用佐剂（明矾alum）乳化的OVA致敏；对照组和SMRT KD cDC1经OVA脉冲4h后经CpG活化2h后于第14天过继转移；第20天，DC过继转移一周后，小鼠左脚垫局部再次经OVA致敏刺激，以诱导超敏介导的炎症反应；在OVA再次刺激后每12h至72h测量足垫肿胀，以检查免疫反应的严重程度（图5A）。结果显示，与对照组cDC1和PBS处理的动物相比，CpG激活的SMRT KD cDC1处理的小鼠脚垫炎症明显增加（图5B）。接下来，检查腘窝淋巴结和腹股沟淋巴结中的T细胞亚型。与PBS处理组相比，注射SMRT KD DC的小鼠显示出明显增加的Th1亚型，表现为IFN-g和T-bet阳性T细胞数量（图5C）。同时，注射SMRT KD cDC1的小鼠中Th17 T细胞数量也显著增加表现为IL-17和RORgt阳性细胞（图5D）。这些结果表明，DC中SMRT敲低会在宿主体内产生非常强烈的炎症T细胞反应。
对SMRT KD cDC1增强细胞毒活性的观察引导进一步研究这些细胞的抗肿瘤潜能。已广泛报道DC疫苗治疗诱导肿瘤相关抗原（TAA）特异性的溶瘤CD8+ T细胞活性。因此，为评估SMRT KD cDC1诱导的细胞毒性CD8 + T细胞增强的生理影响，在C57BL/6小鼠中建立了B16F10黑色素瘤模型。假设，与对照组相比，接种了载有B16抗原的炎性SMRT KD cDC1疫苗的动物能够抵抗不断增加的肿瘤负担。首先，在动物左侧皮下接种SMRT KD和对照细胞，这些细胞之前被B16F10细胞裂解液脉冲处理，以诱导对B16F10肿瘤的免疫。3天后，注射强化剂量。强化剂量7天后，在小鼠右侧皮下注射106 B16F10细胞（图5E）。从肿瘤发生后的第7天到第16天，每隔一天测量一次肿瘤体积。与对照组DC和PBS处理组相比，SMRT cDC1组的肿瘤负荷明显减少（图5F,G）。为进一步评估CD8+ T细胞的细胞毒性，在肿瘤发生后的第16天杀死小鼠，解剖肿瘤并通过胶原酶处理制成单细胞悬液。用PMA/Ionomycin/BFA刺激这些细胞5小时，用流式细胞仪分析CD8+ T-细胞。与对照组或PBS组相比，SMRT KD cDC1接种动物的效应T细胞的细胞毒性显著增强，表现为perforin、GzB和IFN-g阳性群体的比率增加（图5H）。此外，SMRT KD cDC1接种动物肿瘤的重量显著减轻（图5I）。
图5过继转移Control和SMRT KD DC的C57BL/6小鼠的DTH反应和肿瘤消退
7、cDC1中NCoR1和SMRT的比较基因组和转录组分析显示，STAT3信号介导的IL- 10调控存在差异
作者此前发现NCoR1直接结合并强烈抑制DC的耐受性基因，如Il10、Il27、Cd83和Socs3。NCoR1敲除急剧增加了这些基因的表达，从而导致耐受性基因的表达，进而导致了Treg的产生。与此相反，本研究发现，NCoR1同源物SMRT KD MutuDC在体外和体内显著增加炎症反应。因此，作者进行了NCoR1和SMRT的基因组比较，以及NCoR1和SMRT KD DCs的转录组分析，以了解NCoR1和SMRT的不同基因调节。
在CpG刺激6小时下，与对照组比较，SMRT KD cDC1的差异基因表达分析显示，分别有1273和934个基因上调和下调（图6A）。通过SMRT的ChIP-seq分析发现，与下调的基因相比，大量的SMRT结合基因被确定为上调，这支持了其作为辅抑制因子的作用（图6B）。此外，在SMRT KD条件下，直接上调靶基因的IPA分析显示炎症反应途径的上调，如IL-12信号通路（图6C）。然而，与NCoR1相反，SMRT KD显示IL-10信号通路在CpG刺激6h时下调（图6D）。
为识别NCoR1和SMRT KD后表现出不同表达模式的基因集，对DEGs进行无监督K-means聚类，并确定了6个聚类（图6E）。cluster-1中的基因在NCoR1和SMRT KD中均表现出成倍增加的变化，并参与丰富的通路，如“Interferon signaling”，“Activation of IRF by cytosolic pattern recognition receptors”，“IL-12 signaling and production in macrophages”。相反，cluster-2基因在SMRT和NCoR1 KD 6h CpG条件下表现出差异调控，富集的通路为“Th2 pathway”，“STAT3 pathway”，“IL-17-A signaling”和“IL-10 Signaling”（图6F）。这些观察结果清楚地表明，炎症免疫反应基因如Il12b和Il6均被NCoR1和SMRT抑制，而调控基因如Il10、Socs3仅被NCoR1强烈抑制（图6G）。
此外，NCoR1和SMRT峰的差异结合鉴定出NCoR1主导(12,473)、普通NCoR1-SMRT主导(5949)和SMRT主导(2707)基因组区域（图6H, I）。与NCoR1显性区和常见的NCoR1-SMRT结合区主要分布在内含子或远端基因间区相比，SMRT主导区在启动子-近端区域占优势，（图6H）。这进一步表明，SMRT主要通过启动子-近端结合调控基因，而NCoR1和常见的NCoR1-SMRT结合基因则通过远端调控元件调控。
此外，与基因组区域相关的基因KEGG通路分析显示，NCoR1或常见NCoR1-SMRT结合的CpG依赖性增加主要富集“Th1 and Th2 pathway”，“Th-17 signaling pathway”，“NFkB signaling pathway”，“JAK-STAT signaling pathway”（图6J）。CpG激活后，NCoR1和SMRT在TSS的几个近端或远端区域共同占据炎症(Il12b)和耐受基因(Il10)，表明这两种抑制因子都参与调节免疫反应基因（图6K）。
为确定在这些辅抑制子结合的基因组区域在CpG激活6小时前后募集的转录因子，进行de novo基序富集分析，发现PU.1、RUNX2和Jun-Fos/AP1转录因子基序在几乎所有NCoR1都富集，而SMRT结合的基因组区域在未受刺激或CpG激活6小时时富集。有趣的是，NFkB基序在CpG显性NCoR1、显性SMRT和普通NCoR1-SMRT结合位点被富集。在未受刺激和6h CpG激活条件下，IRF8和IRF4基序分别在显性NCoR1和常见NCoR1- SMRT区域富集（图6L）。
除上述基序外，还发现在CpG显性NCoR1-SMRT和CpG显性SMRT基因组区STAT3基序富集。由于NFkB家族成员和Stat3转录因子在调节炎症(Il12b, Il6)和耐受(Il10, Socs3)基因表达中起着重要作用，为进一步了解耐受基因的下调，检测了与Jak-Stat信号通路相关的其他基因的表达。发现其他几种Jak-Stat信号的调控存在明显差异，SMRT KD DC中Jak-Stat信号被下调而NCoR1 KD DC中无变化（图7A, B）。总的来说，基因组和转录组比较分析表明，与NCoR1 KD DC相比，SMRT KD DC显示STAT3-IL-10轴失调。
图6整合基因组学分析（RNA-seq和ChIP-seq）鉴定SMRT和NCoR1在cDC1免疫应答调节中的差异作用
8、SMRT介导的NR4A1下调抑制mTOR-STAT3信号，导致IL-10抑制
STAT3 TF在Jak-Stat信号通路和调控Il10和Socs3的表达中起着核心作用。在SMRT KD cDC1中，NFkB抑制基因Nfkbia和Tnfaip3在CpG刺激6h后也被下调。首先，为确认NCoR1和SMRT中p-STAT3的差异调控，在CpG激活后0h、2h和6h对NCoR1 KD、SMRT KD和对照cDC1中的p-STAT3进行WB。结果显示，与对照细胞相比，SMRT KD cDC1中p-STAT3表达下调，而在NCoR1 KD DC中p-STAT3表达上调（图7C, D）。
据报道，STAT3结合Il10基因调控其表达。所以作者对p-STAT3进行染色质免疫沉淀(ChIP)，然后进行RT-qPCR，以推断对照组、NCoR1 KD和SMRT KD cDC1在CpG处理2h后p-STAT3与Il10基因的结合情况。观察到，相对于对照DC，SMRT KD DC中p-STAT3与Il10的结合减少，而另一方面，与对照DC相比，NCoR1 KD细胞中p-STAT3与Il10的结合增强（图7E）。
此外，为了解这些DC中STAT3信号的上游控制，作者查阅了相关文献，发现mTOR可控制STAT3激活，另一方面mTOR受核受体NR4A1（又叫Nur77）调控。首先检测NCoR1和SMRT敲低cDC1中p-mTOR的调控，发现在NCoR1 KD cDC1中p-mTOR上调，而在SMRT敲低后p-mTOR急剧降低（图7F,G）。此外，在SMRT和NCoR1缺失DC中Nr4a1 (Nur77)的差异调控。SMRT KD导致Nr4a1表达下调，而NCoR1 KD对Nr4a1表达无显著影响（图7H）。使用IGV检测了ChIP-seq数据中NCoR1和SMRT在Nr4a1上的直接结合，观察到在CpG激活6h后，SMRT而不是NCoR1结合TSS转录本（图7H）。作者还通过评估在CpG激活2h和6h前后SMRT KD和对照cDC1中的NR4A1蛋白表达来证实这一结果：与对照细胞相比，SMRT KD DC中的NR4A1蛋白表达显著下调（图7I, J）。
为进一步证实NR4A1确实在SMRT KD细胞中通过mTOR控制STAT3信号，使用NR4A1慢病毒构建了稳定的NR4A1 KD和空载体cDC1细胞，以确认其在mTOR- STAT3 - IL-10信号中的作用。在NR4A1敲除效率通过WB证实（图7K, L）。在CpG激活2h后检测p-mTOR和p-STAT3，发现与对照细胞相比，NR4A1缺失的cDC1中p-mTOR和p-STAT3显著减少（图7K, L）。此外，在NR4A1缺失的cDC1中，CpG处理6h后IL-10阳性细胞显著减少，相应的MFI也减少（图7M）。此外，作者还尝试在SMRT KD cDC1中短暂过表达NR4A1 ORF，但由于过表达质粒转导后细胞状态不佳，未能成功进行这一分析，因此，使用了另一种方法。报道称6- MP可诱导细胞NR4A1的表达。因此，使用6-MP增强SMRT KD cDC1中Nr4a1的表达，看看它是否可以补充IL-10的表达。结果显示6-MP处理增强SMRT KD cDC1中Nr4a1的表达，导致IL-10的表达增加（图7N）。这些结果证实，SMRT KD介导的NR4A1下调导致STAT3激活减少，从而降低IL-10水平，增强cDC1的炎症表型。
图7 Nurr-77、mTOR、Stat3信号调节IL-10在SMRT - KD cDCs中的表达
参考文献：
Jha A, Ahad A, Mishra GP, Sen K, Smita S, Minz AP, Biswas VK, Tripathy A, Senapati SB, Gupta B, Acha-Orbea H and Raghav SK (2022) SMRT and NCoR1 fine-tune inflammatory versus tolerogenic balance in dendritic cells by differentially regulating STAT3 signaling. Front. Immunol. 13:910705. doi: 10.3389/fimmu.2022.910705