LSD1缺失降低胃癌外泌体PD-L1，恢复T细胞应答

组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1 (LSD1)在胃癌(GC)中的表达明显升高，可能与胃癌的增殖和转移有关。据报道，LSD1在黑色素瘤和乳腺癌中通过程序性细胞死亡1配体1 (PD-L1)抑制肿瘤免疫。LSD1在胃癌免疫微环境中的作用尚不清楚。本研究中采用免疫组化(IHC)和免疫印迹(Western Blot)分析胃癌患者LSD1和PD-L1的表达情况。通过体内探索，LSD1 KO(敲除)的小鼠前胃癌(MFC)细胞在615只小鼠体内的生长明显慢于T细胞缺失的BALB/c裸鼠。同时在GC标本中，LSD1的表达与CD8的表达呈负相关，与PD-L1的表达呈正相关。进一步研究表明，LSD1通过诱导外泌体中PD-L1的积累，抑制T细胞在GC微环境中的反应，而在GC细胞中，膜PD-L1保持不变。使用外泌体作为载体，LSD1也阻碍了其他癌细胞的T细胞反应，而LSD1的缺失挽救了T细胞的功能。研究发现，外泌体在依赖供体细胞中LSD1存在的情况下，可调节MFC细胞增殖，其作用与体内外泌体PD-L1介导的T细胞免疫有关。上述结果表明，LSD1缺失降低胃癌外泌体PD-L1，恢复T细胞应答；这一发现提示了LSD1可能调控胃癌肿瘤免疫的新机制，为胃癌的免疫治疗提供了新的靶点。本文于2022年3月发表于Molecular Cancer (IF=41.444)上。

技术路线：

主要研究结果：

(1) LSD1的去除通过抑制GC中T细胞的反应来抑制肿瘤的生长

为了确定LSD1在GC中对肿瘤免疫的调节作用，使用TIMER2.0平台分析了LSD1和免疫细胞信号之间的相关性。在各种免疫细胞中，LSD1与肿瘤浸润CD8+ T细胞呈负相关，主要发生在GC中(图1a)。癌症基因组图谱数据库分析发现，胃癌中LSD1的mRNA与CD8和CD3的mRNA表达呈负相关(图1b)。因此，LSD1被认为是通过抑制T细胞反应来维持肿瘤的生长。在人GC细胞系BGC-823和MGC803以及MFC细胞系中建立LSD1 KO细胞系(补充图未展示)。分别将MFC和MFC LSD1 KO细胞皮下接种于615只小鼠和T细胞缺陷BALB/c裸鼠。在BALB/c裸鼠中，MFC LSD1 KO组的肿瘤重量和体积与MFC组相当，而在615只小鼠中，MFC LSD KO组的肿瘤几乎完全根除(图1c,d)，而它们的体重保持一致(补充图未展示)。这些结果表明，LSD1可能通过抑制T细胞反应来维持肿瘤的生长。此外，将人GC细胞与抗CD3/CD28珠激活的T细胞共孵育，无论LSD1是否被敲除，BGC-823和MGC-803细胞在体外都能稳定生长(图1e)，而当LSD1缺失时，这两种癌细胞更容易被激活的T细胞杀死(图1f)。通过分析图1c中615只小鼠的剥脱肿瘤，LSD1的缺失导致CD8+ T细胞浸润增加(图1g)。综上所述，LSD1是GC中T细胞应答的抑制因子，LSD1的缺失可能通过促进T细胞在体内外杀伤能力而显著抑制GC细胞的生长。

图1：LSD1 KO可通过促进胃癌中T细胞的应答抑制肿瘤生长

(2) GC标本中LSD1与CD8呈负相关，与PD-L1呈正相关

为了探讨LSD1如何影响肿瘤浸润的CD8+ T细胞水平，我们在用我们内部GC标本构建的组织微阵列(TMA)阻滞剂上进行免疫组化，分析LSD1、CD8和T细胞吸引趋化因子、C-X-C基序趋化因子9 (CXCL9)和C-X-C基序趋化因子10 (CXCL10)的表达。图2a,b表明，LSD1在GC组织中过表达，与CD8呈负相关(图2c)，而CXCL9和CXCL10在GC组织中几乎不表达(补充图未展示)。由于抑制LSD1刺激抗肿瘤免疫，增强PD-1/PD-L1阻滞剂在乳腺癌和黑色素瘤中的抗肿瘤疗效，而PD-L1是免疫治疗的有效靶点，可通过结合PD-1抑制T细胞激活，我们推测LSD1可能主要通过抑制PD-L1激活和增殖T细胞而参与胃癌的发展。为探讨胃癌中LSD1与T细胞辅抑制因子PD-L1的相关性，收集36例胃癌标本进行进一步分析。图2d表明，肿瘤组织中LSD1和PD-L1的表达高于癌旁组织，且PD-L1与LSD1呈正相关(图2e)。在TCGA数据库中，PD-L1的表达也与GC中LSD1 mRNA的表达呈正相关(图2f)。这些结果初步支持了我们的假设，LSD1和PD-L1之间可能存在调节关系。

图2：胃癌标本中LSD1表达与免疫调节基因呈正相关

(3) 抑制LSD1可下调GC中PD-L1的水平

为了进一步探讨LSD1对GC中PD-L1的调控作用，我们对GC细胞中总PD-L1和膜PD-L1进行了量化。如图3a,b所示，不同GC细胞系中总PD-L1和膜PD-L1表达明显不均。为了研究LSD1对PD-L1的调节作用，通过使用LSD1抑制剂GSK2879552(图3c,d)或使用sgRNA基因抑制LSD1(图3e,f)。当LSD1被废去后，PD-L1的表达在mRNA水平和蛋白水平上均被下调。膜PD-L1的表达水平没有显著变化(补充图未展示)。已有研究报道PD-L1可通过蛋白酶体和溶酶体途径降解，但LSD1抑制剂是否影响PD-L1的降解途径尚不清楚。采用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺(CHX)和溶酶体抑制剂氯喹(CQ)处理GC细胞。LSD1的缺失并没有减少蛋白酶体和溶酶体对PD-L1的降解(补充图未展示)。为了探究LSD1在内体转运中的作用，我们检测了恢复内体标志蛋白RAB11和多泡小体标志蛋白TSG101。LSD1缺失可增加RAB11的表达，PD-L1与RAB11和TSG101在细胞质中共定位(补充图未展示)。SEM结果还显示，敲除LSD1后，多泡体数量减少(图3g,h)，删除LSD1后，TSG101表达减少(图3i)。以上结果表明，LSD1的缺失可以降低PD-L1的总表达量，维持细胞膜PD-L1水平，减少细胞外通过多泡体分泌PD-L1，促进PD-L1在GC细胞中向膜循环。

图3：抑制LSD1可下调GC中PD-L1基因水平

(4) LSD1缺失下调GC中外泌体PD-L1

已有研究报道外泌体PD-L1也可发挥免疫抑制功能。PD-L1通过外泌体作为载体分泌，可能受LSD1调控。从GC细胞中分离出的外泌体，进行扫描电镜和NTA分析。GC细胞衍生的外泌体的大小在30到200 nm之间(图4a,b)。使用蔗糖梯度离心纯化的外泌体进行的进一步分析表明，外泌体标记CD63、ALG-2相互作用蛋白X (ALIX)和CD9在20-40%的蔗糖馏分中移动，PD-L1与这些外泌体标记共定位(图4c)。PD-L1被打包到GC细胞的外泌体中，PD-L1积累在来自几个人GC细胞系的外泌体中(图4d)。为了进一步证实外泌体中的PD-L1来自癌细胞而非其他成分，采用外泌体分泌抑制剂GW4869抑制胞外囊泡的分泌，当从相同数量的细胞中纯化外泌体时，外泌体分泌明显减少，当BGC-823细胞暴露于GW4869时，观察到膜PD-L1和总PD-L1(补充图未展示)的显著积累。在被抑制的BGC-823和MGC-803细胞中，当LSD1在基因上(图4e)和药理学上(图4f)被删除时，外泌体PD-L1被降低，表明LSD1在正向调节外泌体PD-L1的积累方面具有潜在作用。使用基于磁珠的方法从LSD1缺失的BGC-823和MGC-803细胞中收集的外泌体也比野生型细胞的外泌体含有更少的PD-L1(图4g,h)。当LSD1缺失时，GC细胞来源的外泌体浓度降低(图4i)。因此，我们认为LSD1 KO可以维持细胞膜PD-L1的同时减少外泌体的分泌，抑制外泌体分泌有可能挽救这种作用。用GW4869处理BGC-823细胞，对膜PD-L1进行定量。去除LSD1可以减少PD-L1总量(图3d,f)，但保持膜PD-L1(补充图未展示)。使用GW4869抑制外泌体分泌可以诱导BGC823细胞中膜PD-L1的积累，GW4869还可以在LSD1缺失的BGC-823细胞中重新诱导膜PD-L1的积累(图4j)。综上所述，PD-L1存在于GC细胞衍生的外泌体中，LSD1的去除减少了细胞总PD-L1的量，但保持了膜PD-L1，并减少了外泌体PD-L1的分泌和积累。

图4：LSD1缺失下调GC中外泌体PDL1

(5) LSD1的缺失逆转了GC衍生的外泌体PD-L1的直接T细胞应答抑制

为保证外泌体PD-L1功能的保留，采用PD-1/PD-L1结合试验检测外泌体PD-L1与PD-1的结合能力。标记有PKH26的GC细胞外泌体与重组PD-1涂层的孔结合，当BGC-823细胞中LSD1被删除时，这种结合可以显著取消(图5a)。用GC细胞源性外泌体孵育的T细胞的SEM图像也验证了GC细胞源性外泌体可以直接与T细胞结合，而LSD1 KO消除了这种相互作用(图5b)。为了确定LSD1是否可以通过TCR途径调节外泌体PD-L1介导的免疫抑制作用，采用抗CD3/CD28珠激活健康人体供体PBMCs，并与B-EXO共孵育，用于T细胞刺激模型，并测定T细胞的激活和增殖。以CD8+ T细胞的激活标记CD69为代表，抗CD3/CD28珠大大提高了CD69的表达，B-EXO处理后CD8+ T细胞中CD69表达明显下调，而B KO-EXO或用PD-L1抗体或PD-1重组体阻断外泌体PD-L1的作用挽救了CD8+ T细胞中被抑制的CD69表达(图5c)。T细胞增殖在B-EXO存在时下降，而在LSD1缺失时没有，说明GC细胞源性外泌体的免疫抑制功能被LSD1 KO去除(图5d)，这与外泌体中PD-L1的表达水平一致。为了进一步证实外泌体可以调节T细胞的GC细胞杀伤能力，将激活的PBMCs与GC细胞共培养，并在存在或不存在LSD1的情况下，用BGC-823细胞来源的外泌体处理。外泌体可以减少T细胞杀伤以保持GC细胞存活，而B KO-EXO由于PD-L1的表达极少，对T细胞杀伤没有影响(图5e,f)。T细胞激活过程中分泌的三种主要反应性细胞因子IL-2(图5g)、IFN-γ(图5h)和TNFα(图5i)的分泌也可以被B-EXO抑制，并被B KO-EXO挽救。这些结果一致表明，GC细胞衍生的外泌体可以直接抑制TCR介导的T细胞激活，依赖于LSD1调节的外泌体PD-L1。

图5：LSD1的缺失逆转了GC衍生的外泌体PD-L1的直接T细胞应答抑制

(6) LSD1的缺失通过影响靶细胞中PD-L1的表达，逆转了GC细胞来源的外泌体在T细胞应答中的抑制作用

为了探索GC来源的外泌体向其他癌细胞的转运功能，我们用荧光PD-L1抗体对B-EXO和B KO-EXO进行染色，并与GC细胞系MGC-803孵育。外泌体PD-L1被转运到目标GC细胞中(图6a)。B-EXO可以诱导靶细胞中膜PD-L1的积累，而B-KO-EXO处理的BGC-823细胞中没有显著的PD-L1积累(图6b)；在总PD-L1上也看到了类似的作用(图6c,d)。当B-EXO处理后，PD-1与细胞表面的结合显著增加，而PD-1在B KO-EXO处理的细胞上的结合则保持不变(图6e,f)。活化的T细胞与B-EXO处理的BGC823细胞共孵育时，CD3+CD8+ T细胞中CD69的表达降低，而B KO-EXO处理的细胞组中CD69的表达没有降低(图6g)。辅助T细胞杀伤分析的表型分析也表明，B-EXO处理的GC细胞有逃避T细胞杀伤的意图，而B KO-EXO对癌细胞对T细胞杀伤的敏感性没有显著影响(图6h)。这些结果表明，外泌体中的PD-L1可以运输到其他癌细胞中，从而诱导肿瘤细胞从T细胞的免疫逃逸，而LSD1的缺失降低了GC细胞来源的外泌体的免疫抑制功能，这说明LSD1是一种潜在的肿瘤免疫治疗的免疫抑制因子。

图6：LSD1的缺失通过影响靶细胞中PDL1的表达，逆转了GC细胞来源的外泌体在T细胞应答中的抑制作用

(7) LSD1缺失GC细胞的外泌体在体内通过外泌体PD-L1促进T细胞介导的肿瘤免疫

鉴于GC细胞衍生的外泌体在体外抑制T细胞的激活，我们进行了一个验证性的体内实验。LSD1抑制剂GSK2879552可下调MFC细胞中PD-L1的表达，LSD1缺失可降低外泌体PD-L1的表达，LSD1抑制剂GSK2879552和ORY1001也一样(补充图未展示)。我们使用了615只携带MFC细胞的小鼠建立胃癌模型，以探索胃癌细胞来源的外泌体是否可以调节体内肿瘤的进展。LSD1 KO显著抑制了615只小鼠的肿瘤生长。肿瘤的老鼠注射液从MFC细胞明显大于那些未经治疗的肿瘤(MFC组)，而注射MFC LSD1 KO细胞外泌体的小鼠(MFC+KO EXO组)肿瘤比这两组小得多(图7a-c)。当MFC和MFC LSD1的外泌体与PD-1孵育以阻塞PD-L1外泌体(MFC+CON EXO+PD-1组和MFC+KO EXO+PD-1组)时，MFC+CON EXO+PD-1组、MFC+KO EXO+PD-1组和MFC+KO EXO组之间的肿瘤体积和肿瘤重量无显著差异(图7a-c)。我们推测外泌体治疗在一定程度上抑制了肿瘤中CD8+ T细胞的浸润。与MFC组相比，MFC+CON EXO组CD8+ T细胞比例明显增加，而LSD1 KO细胞衍生的外泌体促进了CD8+ T细胞的比例(图7d)。当PD-1重组蛋白阻断外泌体PD-L1时，MFC+CON EXO+PD-1组CD8+ T细胞比例高于MFC+CON EXO组(图7d)。MFC+KO EXO组与MFC+KO EXO+PD-1组间CD8+ T细胞比例无明显差异(图7d)。肿瘤浸润性CD3和CD8在这些肿瘤中的表达(图7e,f)以及细胞因子IL-2和IFN-γ的数量(图7g,h)的结果一致。携带MFC LSD1 KO细胞的小鼠血浆中外泌体PD-L1的表达量远低于携带MFC细胞的小鼠血浆中表达量(图7i)，提示LSD1具有通过外泌体PD-L1调节全身免疫反应的潜力。总之，LSD1的缺失可以抑制同质GC模型中MFC细胞的增殖。同时，外泌体依靠供体细胞中LSD1的存在，可调节MFC细胞增殖，其作用依赖于体内外泌体PD-L1介导的T细胞免疫。

图7：来自LSD1被废的GC细胞的外泌体在体内通过外泌体PD-L1促进T细胞介导的肿瘤免疫

结论：

综上所述，LSD1的缺失通过减少外泌体中PD-L1的积累来增强T细胞活性，从而抑制肿瘤生长，而在GC细胞中，膜PD-L1保持不变。不仅如此，LSD1以外泌体为载体，通过外泌体PD-L1阻碍了其他癌细胞的T细胞反应，而LSD1的缺失则恢复了T细胞的功能。这些结果揭示了LSD1通过外泌体PD-L1调节T细胞免疫的新途径，为以LSD1为靶点的GC免疫治疗提供了新的策略。

参考文献：

Shen, D. D., Pang, J. R., Bi, Y. P., Zhao, L. F., Li, Y. R., Zhao, L. J., Gao, Y., Wang, B., Wang, N., Wei, L., Guo, H., Liu, H. M., & Zheng, Y. C. (2022). LSD1 deletion decreases exosomal PD-L1 and restores T-cell response in gastric cancer. Molecular cancer, 21(1), 75. https://doi.org/10.1186/s12943-022-01557-1.