Gpx4/GSH抗氧化轴挽救Mtb感染中细胞坏死和宿主耐药

结核分枝杆菌（Mtb）引起的结核病仍然是全球十大死亡原因之一，并且在当前COVID-19以前是单一感染原的主要原因。GSH过氧化物酶4（Gpx4）是一种在预防铁依赖性脂质过氧化介导的细胞死亡中发挥关键作用的酶。本研究说明Gpx4调控的坏死在Mtb感染中的有害作用，并确定Gpx4/GSH抗氧化轴作为宿主定向治疗结核病干预的候选靶点。文章于2022年11月发表在期刊《Journal of Experimental Medicine》上，IF：11.45。

技术路线：

主要研究结果：

1、肺结核患者GPX4/GSH及脂质过氧化水平与肺部疾病的关系

作为评估GPX4在调节脂质过氧化和结核病中潜在作用的第一步，作者首先分析巴西和南非不同队列的结核病患者该途径中的元素。作者采用酶基测定法观察巴西队列，发现与HC相比，肺结核（PTB）患者血浆中GSH水平降低（图1A），脂质过氧化水平升高（图1B）。进一步分析，PTB患者体内的GSH和脂质过氧化物（MDA）水平呈现一个负相关，但HC样本中没有（图1C）。

接下来根据疾病严重程度和肺受损状况对巴西PTB患者进行分层。该分析显示在重度与非重度或单侧与双侧肺病理学上GSH和脂质过氧化水平表现出明显的差异（图1D-E），GSH水平下降与脂质过氧化增强与更严重的疾病密切相关。此外，主成分分析证实该患者队列中疾病严重度、脂质过氧化和GSH水平三者之间的相关性（图1F-G）。这些发现支持人类感染Mtb疾病与GSH调节的脂质过氧化作用相关联，该过程由GPX4进行生化调节。

此外，qRT-PCR显示患有严重疾病的巴西队列的GPX4 mRNA水平显著降低（图1H）。为评估GPX4在PTB疾病中的位置，作者检测巴西PTB病人时候的肺组织，用该酶特异性多克隆抗体孵育后，在肉芽肿边缘的细胞中观察到强烈的GPX4染色，其共定位区域为CD68阳性。相反，在坏死核周围的区域观察到GPX4染色极少（图1I）。因此，与HC相比，PTB患者GSH/GPX4反应与脂质过氧化异常。

图1 PTB患者GSH/GPX4反应与脂质过氧化异常

2、Gpx4在感染Mtb的NHPs和高坏死B6.Sst1^s老鼠肺组织中的表达定位

为进一步拓展对TB病人的认识，作者同样评估感染H37Rv-mCherry Mtb毒株16周后恒河猴肺组织切片GPX4蛋白的表达。从这些动物分离的细胞肉芽肿显示，与位于肉芽肿周围的细胞相比，Gpx4在肉芽肿中心的染色减少（图2A）。值得注意的是，根据感染动物的肺组织切片中GPX4的形态和位置，在类似肺泡巨噬细胞的细胞中检测到GPX4的强烈染色（图2A，左）。此外，从这些恒河猴中获得的坏死肉芽肿在肉芽肿内的活细胞中也表现出更强的GPX4染色（图2A，右）。

为评估Gpx4在小鼠模型中的坏死病理学表达，作者用被气溶胶感染H37Rv Mtb强毒株35 d后的B6.Sst1S小鼠，进行肺组织学检查。虽然该动物品系的整体肺组织病理学不同于NHPs（非人灵长类动物）和人类，但再次观察到肉芽肿病变中心部位的Gpx4染色减少，而位于边缘的细胞和肉芽肿周围的肺组织区域的酶染色增强（图2B，左、中）。有趣的是，在肉芽肿内发生坏死的细胞中观察到Gpx4染色减少（图2B，右）。总之，这些观察揭示实验感染动物肺肉芽肿组织中GPX4空间细胞表达的差异，这将与该酶在调节发病机制中的作用相一致。

图2：Gpx4在感染Mtb恒河猴和B6. Sst1^s老鼠的肉芽肿肺组织中表达空间分布

3、过表达该酶的小鼠肺部病理降低时，Gpx4全基因缺失的感染Mtb小鼠表现出组织坏死增加

为评估Gpx4在Mtb诱导的疾病中的功能作用，作者检测在整体动物或特定细胞区室酶缺陷或转基因过表达Gpx4的小鼠中分枝杆菌感染的结果。

首先研究cre-ERT2posGpx4f1/f1小鼠，tamoxifen治疗后，Gpx4在整个动物（大脑除外）的表达出现整体下降（图3A）。当被气溶胶感染时，与类似感染的非缺陷floxed小鼠（Gpx4f1/f1）相比，这些小鼠的肺部和脾胀均显示明显增加的细菌负荷（图3B-C）。此外，与对照动物的相似染色切片相比，Gpx4缺陷小鼠肺细胞外环境中AFB的数量大幅增加（图3D）。定量分析切片显示，在Gpx4缺陷的肺中，实质区大小和Mtb感染的肉芽肿组织显著增大（图3E-F）。重要的是，与对照组相比，Gpx4缺陷小鼠肺中每个细胞的细菌数量显著增加（图3G）。此外，流式细胞术分析显示，所有Gpx4缺陷动物的肺单细胞悬液中，通过LAA染色测定的CD11b+细胞中脂质过氧化水平增加（图3H）。

下面用Gpx4转基因的小鼠检测Gpx4过表达的影响。与WT非转基因对照小鼠相比，这些动物双肺和脾胀的细菌负荷均有所减少（图3I-J）。SytoxGreen染色测定肺坏死减少（图3K-L）。对Gpx4转基因小鼠肺组织均浆的多重蛋白分析显示，与WT相比，许多与炎症反应相关的细胞因子和趋化因子的水平显著降低（图3M）。有趣的是，与WT动物相比，感染的转基因小鼠还显示出更多的肺泡巨噬细胞（AMs）（图3N）。这提示Gpx4在Mtb感染过程中调节这些细胞的命运中起作用。流式细胞术检测，感染Mtb的Gpx4转基因小鼠的肺中AM和间质巨噬细胞（IMs）的脂质过氧化染色也出现下降（图3O）。

图3 Gpx4基因整体表达的改变调节宿主对Mtb感染的耐药性

4、髓系间室中Gpx4缺失导致Mtb感染小鼠的宿主抵抗力降低和组织坏死增加

Gpx4在肺内的多个细胞系中表达（图4A），可能通过调节对病原体的氧化应激反应来潜在地影响宿主对Mtb的抗性。为评估髓系细胞Gpx4相对于其他产生酶的细胞群的特异性贡献，作者在一系列条件敲除小鼠中检测Mtb感染的结果，这些小鼠具有基因工程的Cre-loxP元件，以靶向Gpx4在含谱系的髓系细胞中的表达。

当通过气溶胶感染H37Rv菌株，CD45creGpx4fl / fl小鼠表现出明显增强的Mtb易感性，几乎比非Gpx4缺陷的floxed对照动物早4个月死亡（图4B）。这种抵抗力的丧失与肺和脾脏中细菌负荷的显著升高以及45 d p.i时明显的肺坏死有关（图4C-E），这让人联想到上面在感染的cre-ERT2+Gpx4fl/fl小鼠中观察到的情况。与这些发现一致的是，与感染非缺陷型Gpx4f1/f1动物相比，Mtb感染CD45 creGpx4fl/fl小鼠的肺匀浆显示促炎细胞因子和趋化因子水平升高，最显著的变化发生在IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-17水平以及KC/CXCL1和MCP-1/CCL2（图4F）。此外，流式细胞术分析显示，Mtb感染CD45 creGpx4fl/fl小鼠肺中AM的频率和数量显著减少（图4G-H），同时IM增加（图4G-I）。有趣的是，这些动物在肺髓样腔室中也表现出Ly6G表达细胞的优先富集（图4J）。虽然认为这些CD45creGpx4fl/fl动物中Gpx4缺乏的影响并非髓系细胞所特有，但通过LAA染色测量和流式细胞术分析，研究的每个个体髓系细胞群均显示脂质过氧化增加（图4K）。

作者接下来检查LysMcreGpx4fl/fl小鼠的Mtb感染，该小鼠在骨髓隔室中特异性地显示出Gpx4表达缺陷。尽管其表型不如在CD45 creGpx4fl/fl小鼠中观察到的严重，但LysMcreGpx4fl/fl小鼠也表现出对Mtb感染的易感性增加，如120 p.i.时死亡率增加以及肺和脾细菌负荷增加（图5A-B）。此外，对这些动物的肺组织病理学检查显示单个核细胞中抗酸细胞数量增加（图5C）。流式细胞术对单细胞悬浮液进行分析，Mtb-infected LysMcreGpx4fl / fl老鼠中对活的IM总数量无变化（图5D, F），120 p.i.时表现出AM的深度消耗（图5D-E）。此外，在这些动物的IM中检测到脂质过氧化物水平升高，同时IM标记染色的死亡细胞数量增加（图5G-H）。中性粒细胞在Mtb-infected LysMcreGpx4fl / fl老鼠的肺实质中富集，同时也表现出脂质过氧化增强和在肺实质中积累为死细胞（图5I-K）。然而，在Mtb-infected LysMcreGpx4fl/fl小鼠的肺部观察到的炎症表型似乎不是Gpx4对中性粒细胞的作用引起的，因为Gpx4缺陷是专门针对Mtb-infected Mrp8 creGpx4fl/fl小鼠细胞的，在生存和细菌负荷方面，均未检测到的宿主对病原体的抗性损失（图5L-M）。

总之，这些发现表明Gpx4在巨噬细胞/单核细胞，而不是中性粒细胞中的细胞内在表达，对于研究Mtb感染中的宿主抗性的实验是重要的。

图4造血腔内Gpx4表达的缺失增强宿主对Mtb感染的易感性

图5 Gpx4表达对体内巨噬细胞抵抗Mtb感染具有重要作用

5、髓系靶向缺失Gpx4表达的Mtb感染小鼠BMDMs表现出增强的铁死亡

Gpx4是细胞铁死亡的调控中心，之前的体内体外实验都发现Mtb感染引发的细胞坏死。为正式测试Gpx4在Mtb诱导的细胞死亡中的作用，作者研究来自骨髓细胞中Gpx4靶向缺失的LysMcreGpx4fl/fl和CD64creGpx4fl/fl小鼠的BMDMs。流式细胞术分析，当感染多重度（MOI）为5时，来自这些小鼠品系的巨噬细胞培养在第1天和第4天均显示出Mtb诱导的细胞死亡增强（图6A-B）。这种增强的细胞坏死与线粒体超氧化物水平升高以及脂质过氧化升高有关（图6C-D），且导致细胞外环境中细菌负荷增强（图6E）。有趣的是，当MOI为1时，对感染Mtb的培养物进行检测，发现在两种条件敲除的巨噬细胞群体中，Gpx4表达的缺失也被发现与胞内细菌生长增加有关。这种效应被治疗抑制ferrostatin-1（Fer-1；图6F）。重要的是，在高MOI的Mtb感染的Gpx4缺失巨噬细胞培养物中，Fer-1的加入显著抑制细胞坏死的增加（图6G-I）。总之，这些体外观察支持Gpx4在调节Mtb诱导的细胞铁死亡中的主要作用，同时揭示该酶在控制细胞内细菌生长方面的潜在功能。

图6 Gpx4缺失在体外Mtb感染的巨噬细胞中触发脂质过氧化依赖性坏死和细菌控制的丧失

结论:

综上所述，作者研究Gpx4调节的脂质过氧化与mtb4感染人类以及小鼠肺结核实验模型中宿主耐药性和疾病的关系，并从Mtb4感染的NHPs肺切片中酶的组织染色中提供支持数据。作者发现更严重疾病的患者表现出外周血单个核细胞循环单核细胞中GPX4表达减少，GSH减少以及血浆中脂质过氧化物水平升高。进一步证明，在体内和体外，Gpx4表达的降低与坏死、脂质过氧化和细菌生长的增加有关，而Gpx4表达的增强在体内具有相反的结果。通过条件敲除小鼠以及体外感染实验，揭示髓系细胞的Gpx4表达在决定这些结果中起着核心作用。这些发现支持铁死亡在Mtb诱导的细胞坏死中的作用，并暗示Gpx4/GSH轴是结核病的宿主定向治疗的靶点。

参考文献

Amaral EP, Foreman TW, Namasivayam S, Hilligan KL, Kauffman KD, Barbosa Bomfim CC, et al. (2022). GPX4 regulates cellular necrosis and host resistance in Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med; 219(11):e20220504. doi: 10.1084/jem.20220504.