SDCBP-AS1通过调控hnRNP K的泛素化和SUMO化来破坏β-catenin的稳定，从而抑制胃癌的发生和转移

胃癌（GC）是全球癌症相关死亡的主要原因，尽管其发病率因不同地理区域而异。尽管标准化治疗在过去十年中提高了患者的生存率，但5年生存率仍然很低。早期发现可以在很大程度上提高5年生存率；然而，由于缺乏有效的诊断和治疗策略，中国超过80%的GC患者在诊断时患有晚期疾病，5年生存率低于20%。因此，迫切需要新的生物标志物和治疗靶点用于GC的诊断和预后预测，以降低死亡率。该研究发表于《Cancer Communications》，IF: 15.283。

技术路线：

主要研究结果：

1. GC组织中SDCBP2-AS1的下调表明结局不佳

作者研究了SDCBP2-AS1表达与临床样本不同临床病理特征之间的潜在关联。结果表明，与匹配的相邻非肿瘤组织相比，GC组织中SDCBP2-AS1表达显著降低（图1A-B）。根据从截止查找器获得的SDCBP2-AS1的临界值（0.0058），将患者分为SDCBP2-AS1高表达组（n=59）和低表达组（n=73）。值得注意的是，SDCBP2-AS1的低表达与GC患者中腺癌（P=0.033）、肿瘤较大（P =0.016）、淋巴结转移（P <0.001）、远处转移（P =0.036）和晚期病理性TNM（p<0.001）分期（P 0.001）有关。Kaplan-Meier生存分析显示，低SDCBP2-AS1组的DFS和OS率低于高SDCBP2-AS1组（图1C）。单因素和多因素分析表明，SDCBP2-AS1表达是GC的独立预后因素。为了验证这些发现，使用Kaplan-Meier绘图仪使用数据集探索SDCBP2-AS1过表达与生存之间的潜在关联GSE22377。结果表明，SDCBP2-AS1的低表达与较短的OS和DFS有关（图1D）。这些发现证实，SDCBP2-AS1的低表达可预测GC患者的预后不良。

图1 SDCBP2-AS1在GC组织中下调，表明患者预后不良

2. SDCBP2-AS1在体外抑制GC细胞的增殖和转移

使用两种shRNA在BGC823和MKN28细胞中敲低SDCBP2-AS1。SDCBP2-AS1在SGC7901细胞中过表达。RT-qPCR分析用于确定转染的有效性。细胞增殖和集落形成测定表明，敲低SDCBP2-AS1显著促进了两种细胞系的增殖和集落形成（图2A-B），而SCBP2-AS1的过表达具有相反的效果（图2C-D)。进一步探讨了SDCBP2-AS1对GC细胞转移的影响。Transwell和伤口愈合测定的结果表明，SDCBP2-AS1的沉默增加了BGC823和MKN28细胞的迁移和侵袭（图2E-F），而SDCBP2-AS1的过表达增强了SGC7901细胞的迁移率（图2G-H)。这些体外数据表明，敲低SDCBP2-AS1积极促进GC细胞的增殖，迁移和侵袭。

图2 SDCBP2-AS1在体外抑制GC细胞增殖和转移

3. SDCBP2-AS1 抑制体内 GC 细胞的生长和转移

使用体内异种移植肿瘤和裸鼠肺转移模型测定SDCBP2-AS1对GC细胞致瘤和转移能力的影响。通过皮下注射稳定转染shSDCBP2-AS1#1（sh1）或NT对照的BGC823细胞建立异种移植肿瘤模型。由此产生的肿瘤明显更大，并且在sh1组中表现出比NT组更快的生长（图3A-C）。通过对Ki-67的H&E和IHC分析染色进一步证实了这种差异，结果表明，与NT组相比，sh1组在肿瘤组织中的Ki-67表达显着增加（图3D）。此外，肺转移模型显示，NT组的转移性病变比sh1组少（图3E-F）。通过对Ki-67的H&E和IHC分析对肺组织切片进行染色，进一步证实了这种差异（图3G）。综上所述，这些体内结果支持SDCBP2-AS1在GC中的肿瘤抑制作用。

图3 SDCBP2-AS1抑制体内GC细胞的生长和转移

3.4. SDCBP2-AS1 与细胞质中的 hnRNP K 相互作用

为了确定潜在的机制，使用RNA-FISH和RNA亚细胞分离研究了SDCBP2-AS1在GC细胞中的分布。结果表明，SDCBP2-AS1在细胞质中更为普遍（图4A-B）。此外，使用生物素化SDCBP2-AS1进行RNA下拉测定法来鉴定SDCBP2-AS1的蛋白质伴侣。通过电泳分离回收的蛋白质并进行银染。最后，选择几个差分带进行质谱分析，证实hnRNP K与SDCBP2-AS1相互作用，但与反义SDCBP2-AS1不相互作用（图4C-D）。接下来，体内RIP分析显示hnRNP K与BGC823细胞中的SDCBP2-AS1相互作用（图4E）。总的来说，这些发现证明了SDCBP2-AS1和hnRNP K之间的相互作用。为了确定SDCBP2-AS1的哪些区域与hnRNP K结合，根据SDCBP2-AS1的预测二级结构构建了一系列SDCBP2-AS1缺失突变体（图4F）。RNA片段在体外从RNA下拉测定的缺失构建体转录（图4G）。不同 SDCBP2-AS1 RNA 片段拉下的蛋白质样品中 hnRNP K 的免疫印迹分析表明，核苷酸 541-2479 缺失的 RNA 片段完全失去了与 hnRNP K 结合的能力（图4H）。外显子2的序列可以与hnRNP K相互作用，其RNA二级结构与SDCBP2-AS1的全长序列完全不同。因此，外显子3序列被确定为SDCBP2-AS1和hnRNP K之间相互作用所必需的（图4H）。此外，hnRNP K具有几个参与RNA-蛋白质相互作用的功能结构域，据报道涉及三个K同源（KH）结构域（KH1，KH2和KH3）。然而，位于 KH2 和 KH3 结构域之间的 KI 结构域介导 hnRNP K 活性，尽管潜在机制尚不清楚。BGC823细胞中一系列标记的hnRNP K缺失突变体的RIP测定（图4I-J）表明KH3与SDCBP2-AS1结合的能力最大，而其他结构域与SDCBP2-AS1相互作用的能力没有显着差异（图4K）。这些结果确定了SDCBP2-AS1的特定区域，这些区域能够与GC细胞中的hnRNP K蛋白结构域结合。

图4 SDCBP2-AS1与细胞质中的hnRNP K相互作用

5. 沉默 SDCBP2-AS1 稳定的β连环蛋白和禁止的转录活性

为了鉴定SDCBP2-AS1的推定靶标，进行了RNA测序以获得敲低SDCBP2-AS1后BGC823细胞的转录谱。在301个差异表达基因中，SDCBP2-AS1敲低组有51个上调，250个下调（图5A）。此外，RNA-seq数据的GSEA表明，SDCBP2-AS1的敲低与β-连环蛋白的过表达呈正相关（图5B）。lncRNA的亚细胞定位与功能。SDCBP2-AS1主要位于细胞质中，与β连环蛋白表达相关，提示SDCBP2-AS1干扰β连环蛋白的降解。为了确认，蛋白质免疫印迹分析显示，敲低SDCBP2-AS1显著提高了BGC823和MKN28细胞中β连环蛋白和hnRNP K的蛋白水平，而过表达SDCBP2-AS1的SGC7901细胞的β-连环蛋白和hnRNP K的表达水平较低（图5C）。此外，蛋白质印迹分析显示，敲低SDCBP2-AS1导致细胞质中β连环蛋白的表达降低，细胞核中表达较高（图5D）。hnRNP K的结果相反。IF测定的结果表明，SDCBP2-AS1改变了GC细胞中细胞核和细胞质之间β连环蛋白的穿梭（图5E）。TOP/FOP闪光素酶测定的结果显示，SDCBP2-AS1敲低细胞中激活了β连环蛋白信号传导（图5F）。此外，RT-qPCR和蛋白质印迹分析结果表明，SDCBP2-AS1的稳定过表达或敲低改变了β连环蛋白下游基因（即CCND1、MYC和MMP7）的表达模式。β连环蛋白的易位激活了Wnt信号通路，特别是通过Wnt3a，而不是Wnt5a（图5G-H）。综上所述，这些结果表明，敲低SDCBP2-AS1有助于稳定β连环蛋白并激活规范的Wnt信号通路。

图5 SDCBP2-AS1的沉默稳定β连环蛋白和禁止的转录活性

6. SDCBP2-AS1 通过阻断 GC 细胞中 hnRNP K 的 SUMO化来破坏β连环蛋白的稳定性

由于发现SDCBP2-AS1在不同方向上调节β-连环蛋白和hnRNP K的蛋白质水平，SDCBP2-AS1也可能调节转录后修饰。因此，蛋白质合成抑制剂CHX用于评估SDCBP2-AS1对β连环蛋白稳定性的影响。用CHX处理后，所有组中β连环蛋白的蛋白质合成均显着下降，这意味着SDCBP2-AS1的敲低或SDCBP2-AS1的过表达不影响β连环蛋白的蛋白质合成（图6A）。此外，与蛋白酶体抑制剂MG132孵育后，SDCBP2-AS1的敲低和过表达对GC细胞中β连环蛋白的降解具有相似的作用（图6B）。SDCBP2-AS1调节β连环蛋白的降解，但不能调节合成。进行IP分析以确定SDCBP2-AS1是否参与形成靶向内源性β连环蛋白的降解复合物。由于APC、Axin1和GSK3β是诱导β连环蛋白降解的主要成分，因此在没有SDCBP2-AS1的情况下，β连环蛋白与破坏复合物之间的相互作用降低（图6C），表明SDCBP2-AS1可能干扰β连环蛋白的降解。SDCBP2-AS1的过表达一致地促进了β连环蛋白的泛素化和降解（图6C）通过与 hnRNP K 结合。在没有SDCBP2-AS1的情况下，β连环蛋白的泛素化是不完全的（图6D）。作者构建了一系列Flag标记截短的hnRNP K蛋白，蛋白质结构域图谱研究表明，hnRNP K的KH3和KI结构域对于其与β连环蛋白的相互作用至关重要（图6E）。同时，HA标记的β连环蛋白截断突变体的免疫沉淀表明，β连环蛋白的所有结构域都参与其与hnRNP K的相互作用，尽管全长具有最大的结合能力（图6F）。此外，SDCBP2-AS1主要与hnRNP K的KH3结构域相互作用。在KH3区域已经报道了几个翻译后修饰位点，例如位于422位的赖氨酸残基，它被确定为hnRNP K的主要SUMO化位点。因此，研究了SDCBP2-AS1调控hnRNP K翻译后修饰的能力，特别是KH3结构域的SUMO化和泛素化。SDCBP2-AS1的敲低增加了野生型的SUMO化，但K422R突变体没有增加（图6G），以及 hnRNP K 的内源性多泛素化减少（图6H）。与K422R突变体相比，SDCBP2-AS1通过阻断空间结构中KH3结构域的特定活性位点来改变SUMO化。这些结果表明，敲低SDCBP2-AS1导致β连环蛋白在细胞质中的积累，随后通过稳定GC细胞中的β连环蛋白进行核易位。

图6 SDCBP2-AS1通过阻断HNRNP K的SUMO化来破坏β连环蛋白的稳定性

7. SDCBP2-AS1 的肿瘤抑制功能通过与 hnRNP K 的相互作用部分发挥

建立具有稳定敲低hnRNP K的SGC7901细胞，以评估GC细胞中SDCBP2-AS1和hnRNP K之间的相互作用。此外，SDCBP2-AS1被过度表达以确定hnRNP K是否是关键介质。沉默hnRNP K消除了SDCBP2-AS1的肿瘤抑制功能，包括细胞增殖和迁移（图7A-C）。IF和蛋白质印迹测定的结果表明，如果没有hnRNP K，SDCBP2-AS1无法促进GC细胞中β连环蛋白的核易位（图7D-E）。此外，TOP/FOP-闪光素酶、qPCR 和蛋白质印迹测定的结果表明，如果没有 hnRNP K，SDCBP2-AS1 无法激活下游靶基因和 Wnt/β-连环蛋白通路的转录（图7F-H）。在异种移植肿瘤模型中，SGC7901细胞中hnRNP K的稳定敲低消除了SDCBP2-AS1过表达引起的生长速率和肿瘤重量的差异（图7I-K）。

图7 SDCBP2-AS1通过与hnRNP K的相互作用部分发挥肿瘤抑制功能

结论：

该研究报道了SDCBP2-AS1作为一种新型肿瘤抑制因子lncRNA，可抑制GC细胞的增殖和转移。SDCBP2-AS1的肿瘤抑制功能通过直接与hnRNP K结合调节hnRNP K和β-连环蛋白的转录后修饰，从而促进β连环蛋白的降解。一致地，通过丢失 SDCBP2-AS1 稳定β连环蛋白导致 GC 患者预后不良，表明 SDCBP2-AS1 可能是 GC 患者的潜在诊断和预后生物标志物。

示意图：

说明SDCBP2-AS1诱导抑制GC肿瘤发生的机制：

参考文献：

Han J, Nie M, Chen C, Cheng X, Guo T, Huangfu L, Li X, Du H, Xing X, Ji J. SDCBP-AS1 destabilizes β-catenin by regulating ubiquitination and SUMOylation of hnRNP K to suppress gastric tumorigenicity and metastasis. Cancer Commun (Lond). 2022;42(11):1141-1161. doi: 10.1002/cac2.12367.