短平快，10分文章的套路：仅3对细胞外泌体测序+30例血清外泌体PCR
尽管在高级别星形细胞瘤(HGA)的组织病理学诊断方面取得了重大进展，但有效的非侵入性诊断方法在很大程度上仍然未知。外泌体可以穿过血脑屏障，在人类生物液体中很容易获得，使它们成为HGA的有前途的生物标志物。环状RNA(circRNAs)由于其稳定性、保守性和组织特异性，具有作为肿瘤生物标志物的潜力。然而，外泌体circRNAs在HGA中的分布和特征仍有待研究。该研究于2022年2月发表在《Clinical Chemistry》，IF：12.167。
技术路线
研究结果
1原代HGA细胞和配对外泌体的circRNA图谱特征
CircRNAs是由癌细胞中的外泌体分泌到血液、尿液、母乳和唾液等体液中。血清外泌体取决于分泌细胞的来源。因此，从新病理诊断的HGA样本(WHO分级IV)中培养3个原代肿瘤细胞(图1A-C)。接下来检查HGA样本和原发肿瘤细胞的重要分子特征。结果发现3种HGA组织的分子模式相似，在所有3个原发肿瘤细胞中均出现异柠檬酸脱氢酶1突变，O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶甲基化杂合子模式缺失1p(图1D-G)。从3个原代培养的HGA细胞(T01,T03和T05)及其配对的细胞衍生外泌体(T02,T04和T06)中使用特定的circRNA深度测序对circRNA转录物进行了描述(图1H-J)。
在原代HGA细胞和配对的细胞衍生外泌体中，总共发现了8117和2633个circRNA，与外泌体相比，HGA细胞中的circRNA浓度增加(每10亿个mapping reads的剪接reads的平均值[SRPBM])(图2A)。其次，与HGA细胞circRNA的基因组位置一致，观察到HGA细胞衍生的外泌体circRNA主要来自外显子区域(分别为87.53%和88.23%)，而其他circRNA则来自内含子区域(分别为9%和8.5%)和基因间区域(分别为3.47%和3.27%)(图2B)。26个高水平细胞circRNA产生宿主基因(上)和12个高水平外泌体circRNA产生宿主基因(下)的GO注释如图2C。HGA细胞circRNA(上)和HGA细胞衍生的外泌体circRNA(下)的染色体分布如图2D。接着发现HGA细胞衍生的外泌体circRNA的浓度与HGA细胞circRNA的浓度只是适度相关(图2E)。大多数外显子circRNA长度不超过1000 nt，而51.16%的内含子circRNA和52.23%的基因间circRNA长度超过3000 nt(图2F)。
2 肿瘤细胞的高水平短外显子circRNAs更容易在外泌体中富集
26个高表达的circRNAs共存于3个肿瘤细胞的circRNAs中，产生这26个富集的circRNAs的宿主基因具有独特的分子功能和特征。真核生物同源组(KOG)分析显示，最丰富的类别是“general functional prediction only”，其次是“signal transduction mechanisms”(图3A)。进一步研究了12种circRNAs是否普遍富集于3个HGA细胞配对的外泌体中，宿主基因KOG分析显示，最大的KOG群是“general functional prediction only”和“cytoskeleton”(图3B)。有趣的是，几乎所有高水平HGA细胞衍生的外泌体circRNAs都包含在HGA细胞circRNAs中(图3C)。还发现这11个circRNAs起源于外显子区域(11/11)。CircRNAs的长度在200-1400 nt之间，63.63%的circRNAs长度约为400 nt(图3D)。图3E表明高通量测序和qRT-PCR的结果基本一致。以上数据支持HGA细胞高表达和短外显子的circRNAs更容易在外泌体中富集，并且这些circRNAs的含量在外泌体中极度富集。此外，在原代HGA细胞T03中未发现外泌体T04中的122个circRNAs，在原代HGA细胞T05中未发现外泌体T06中的79个circRNAs(图3F)。作者推测外泌体中可能存在circRNA剪接/形成的机制，值得进一步探索和验证。
3 组织circRNAs在HGA预后监测中的应用
发现2633个circRNAs被包装在3个原代HGA肿瘤细胞源性外泌体中，然而无法确定circRNAs在HGA肿瘤组织和正常组织中是否存在差异。首先，在HGA细胞衍生的外泌体中随机选择32个circRNAs，检测其在30例HGA患者和12例正常人中的表达(图4A)。与正常组织相比，几乎所有32种circRNAs在肿瘤组织中的表达浓度都较低。8个外显子circRNAs在两种组织类型中的表达差异非常显著(图4B)。circRNAs hsa_circ_0005019、hsa_circ_0000880、hsa_circ_0051680和hsa_circ_0006365可以作为HGA的预后标志物，这些circRNAs的高表达预示着HGA患者预后良好(图4C)。
图4 CircRNAs在HGA预后中作为组织活检靶点
4、血清外泌体circRNAs在液体活检中用于HGA的早期筛查
作者检测了HGA患者和健康人的血清外泌体中32种选定的circRNAs的表达(图5A)。3种circRNAs(上调的hsa_circ_0075828、下调的hsa_circ_0003828和下调的hsa_circ_0002976)在正常和HGA血清外泌体中的表达差异最大(图5B)。计算了用于HGA检测的这些circRNAs曲线下的面积。hsa_circ_0075828、hsa_circ_0002976和hsa_circ_0003828的曲线值下面积在0.8111到0.9861之间(图5C)。这3种circRNAs可准确区分HGA患者(30例)与健康个体(12例) (表1)。总之，circRNA hsa_circ_0075828、hsa_circ_0002976和hsa_circ_0003828的组合可以作为外泌体circRNA面板，用于HGA的敏感和精确筛选。
图5 血清外泌体circRNAs在HGA诊断中作为液体活检靶点
结论
这项研究揭示了HGA外泌体和细胞中全面的circRNAs景观。血清外泌体circRNAs、外泌体circRNAs面板和组织circRNAs对HGA液体活检和预后监测具有潜在的作用。外泌体circRNAs作为新的靶点，有助于进一步发现生物标志物，并有助于HGA的诊断和治疗监测。