脂肪多糖衍生亚油酸促进米色脂肪祖细胞增殖
新生米色脂肪细胞的生物发生涉及白色脂肪组织（WAT）中祖细胞的增殖；然而，是什么调控了这一过程仍不清楚。在这里，本演技报告了在小鼠模型和人类组织中，WAT脂解衍生的亚油酸在冷适应、b3-AR激活和烧伤后触发米色祖细胞增殖。细胞表面标记物PDGFRa或Sca1和CD81标记的脂肪祖细胞亚群含有丰富的嵴线粒体，并通过脂肪酸转运蛋白CD36主动输入亚油酸。口服补充亚油酸，即使在热中性条件下以CD36依赖的方式刺激米色祖细胞增殖。总之，本研究结果为多样化的病理生理提供机制性的见解。本研究于2022年12月发表于期刊《Developmental cell》上，IF：1.417。
技术路线：
主要研究结果：
作者建立在他莫昔芬处理后的CD81 +细胞中选择性缺乏脂肪生成主要调节因子PPARg的小鼠。为此，作者在PpargCD81 KO小鼠中建立了他莫昔芬治疗后在CD81 +细胞中选择性缺乏脂肪生成的主要调节因子PPARg的小鼠（图1A）。小鼠在30℃下接受他莫昔芬治疗，随后适应8℃。冷刺激下，对照组小鼠（Ppargflox/flox）在腹股沟WAT（白色脂肪组织）的前、中、后区有大量表达UCP1（解偶联蛋白1）的多室脂肪细胞簇，这是米色脂肪细胞的一个形态学特征（图1B）。相比之下，PpargCD81 KO小鼠腹股沟WAT在冷刺激下白色脂肪组织大大受损（图1B）。与形态学变化一致，PpargCD81 KO小鼠腹股沟WAT中棕色/米色脂肪选择基因UCP1、Pgc1a、Cidea和Elovl3的表达水平明显低于对照组小鼠（图1C）。这些结果说明大量冷刺激诱导下的白色脂肪组织起源于小鼠腹股沟WATCD81+祖细胞（APC）。作者发现腹股沟WAT中CD81 +APC（Lin- : Sca1 + : CD81 + : Ki67 +）在冷暴露3天内Ki67 +细胞群数量显著增加（图1D）。用CD81-lineage reporter小鼠进行组织学分析也表明腹股沟WAT的基质细胞共表达GFP和Ki67，Ki67+ GFP+细胞的数量在冷刺激下显著增长（图1E-F）。除了冷刺激，用b3-AR治疗3天，相较于载体处理小鼠WAT，治疗后小鼠腹股沟WAT中Ki67+和CD81+细胞增多（图1G）。FACS（荧光激活细胞分选术）定量地检测来自活检组织Lin svf中Ki67+和CD81+细胞的数量，发现CL316,243在体外培养的小鼠腹股沟WAT中以剂量依赖的方式显著增加Ki67+和CD81+细胞的数量（图1I）。在人WAT中b3-AR治疗也显著增加Ki67+和CD81+细胞的数量，尽管处于非刺激下的Ki67+和CD81+细胞数量与个体之间的有所不同（图1J）。
根据在小鼠中建立的方案，在烧伤和假手术处理后，作者将获得腹股沟WAT 1天、3天和7天的C57BL/6J小鼠（图2A）。烧伤后3天和7天血浆游离脂肪酸（FAA）水平明显高于对照组小鼠（图2B）。烧伤后7天，受伤小鼠腹股沟WAT各区域均有大量多房型米色脂肪细胞，其中大部分表达UCP1蛋白（图2C）。与对照组小鼠相比，在烧伤后7天，形态变化伴随着棕/米色选择基因的表达增加，如Ucp1、Elovl3、Dio2和Cox8b（图2D）。重要的是，作者发现在烧伤3天和7天后，小鼠腹股沟WAT中Ki67+CD81+细胞显著增多（图2E-F）。这些结果表明米色脂肪发生的病理刺激包括WAT中CD81+祖细胞的增殖。
图2 烧伤促进CD81+ APC细胞增殖
3、脂肪分解是米色脂肪细胞增殖所必需的
为验证猜想WAT脂肪多聚物衍生因子介导米色祖细胞的增殖，作者使用缺乏脂肪肝三酯脂肪酶（ATGL）小鼠，即Adipo-ATGL KO小鼠。在这个实验中，Adipo-ATGL KO小鼠和它的同窝出生的小鼠在30℃下生存14天，随后8℃下生存3天（图3A-B）。
冷驯化3天后，对照组小鼠腹沟WAT库的组织学分析发现大量米黄色脂肪细胞，多房脂质和UCP1表达，特别是在中间区域。相反，在AdipoATGL KO小鼠中，冷诱导的米色脂肪细胞的生物生成几乎完全消失（图3C）。此外，adipocyte-specificATGL缺失显著降低了在腹股沟WAT中棕色/米色脂肪选择基因的表达，包括Ucp1、Pgc1a、Cidea、Dio2、Cox8b和Prdm16（图3D）。
接着FACS检测30C和冷驯化后小鼠腹股沟WAT中CD81+细胞的增殖。30℃时，Ki67+ CD81+细胞数量在基因型间无差异。冷驯化显著增加对照组小鼠Ki67+ CD81+细胞数量；然而，这种冷诱导的米色祖细胞增殖在Adipo-ATGL KO小鼠中完全消失（图3E）。当CL316243处理体外培养的腹股沟WAT时，观察到对照小鼠来源的WAT库中的CD81+ Ki67+细胞的数量显著增加。相比之下，CL316243在AdipoATGL KO小鼠中的刺激作用减弱（图3F）。与遗传学研究一致的是，Atglistatin对ATGL的药理抑制有效的阻断CL316243对野生型小鼠腹股沟WAT中CD81+细胞增殖的刺激（图3G）。
图3 CD81+ APC细胞增殖需要脂解作用
4、亚油酸刺激米色脂肪祖细胞增殖
作者下面鉴定脂质分解因素介导的米色脂肪细胞增殖（图4A）。煮沸培养基中的脂质提取物能够刺激CD81+细胞增殖（图4B）。随后，作者基于前人的数据库和质谱循环分析证明了冷刺激和b3-AR治疗都能持续的增加，如图4C所示的6种脂肪酸。补充亚油酸显著刺激CD81+细胞的增殖，而其他细胞没有明显变化（图4D）。亚油酸处理通过增加S期和G2-M期细胞数量促进细胞增殖，CD81+细胞优先增殖（图4E）。同时，作者也发现是亚油酸，而不是a亚麻酸或反亚麻酸，亚油酸的几何异构体促进CD81+细胞增殖（图4F）。为检测口服亚油酸是否促进体内米色细胞增殖，野生型雄性小鼠在30℃条件下，每天摄入浓度为1%的亚油酸（图4G）。FACS检测发现口服亚油酸可使小鼠体内Ki67+ CD81+细胞显著增加3倍（图4H）。尽管8℃的冷刺激会促使处理过的小鼠米色脂肪的生物生成，但是补充亚油酸进一步促进小鼠米色脂肪的生物生成（图4I）。作者发现补充亚油酸增强腹股沟WAT中CD81+细胞米色脂肪的生成（图4J）。作者发现补充亚油酸可以有效刺激对照组中小鼠腹股沟WAT中米色脂肪的生成，而在PpargCD81 KO小鼠中这种作用明显减弱（图4K）。与分子分析一致的是，腹股沟WAT的组织学分析显示PpargCD81KO小鼠的多房米色脂肪细胞比对照组少（图4L）。这些结果表明，当补充亚油酸和冷刺激结合时，增强CD81+细胞来源的新生米色脂肪的生物生成。
图4 亚油酸刺激CD81+APC增殖
5、米色脂肪祖细胞中活跃的线粒体代谢和花生四烯酸通路
为探索亚油酸刺激米色祖细胞增的机制，作者对腹股沟WAT中原生CD81+和CD81-细胞进行RNA测序。与之前的分析一致，转录组学分析显示，与CD81-细胞相比，CD81+细胞表达出高水平的平滑肌基因富集，包括Acta2、Sm22和Myh11（图5A）。值得注意的是，CD81+细胞表达的线粒体编码基因，如Atp6、Atp8、Cox1、Cox2和Cytb，明显高于来自腹股沟WAT的CD81-细胞（图5A）。电子显微镜（EM）中发现CD81+细胞中含有大量的线粒体，其中许多线粒体呈球形或椭圆形，并平行于致密嵴，表现出棕色前脂肪细胞的形态学特征（图5B）。此外，CD81+细胞的耗氧率明显高于基础状态和羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP）处理后的CD81细胞（图5C）。补充亚油酸通过增强FA氧化进一步激活CD81 +细胞的生物能量学，因为肉碱棕榈酰转移酶（CPT）抑制剂（乙莫克害）抑制FA氧化减弱亚油酸对细胞呼吸的刺激作用（图5D）。
从转录组数据中发现CD81+细胞与CD81细胞相比，花生四烯酸合成途径高度富集（图5E）。接下来，脂质组学检测暴露8℃ 3天的小鼠原代CD81+和CD81-细胞中前列腺素的水平。分析发现PGD2在CD81+细胞中的水平显著高于CD81-细胞（图5F）。随后，液相色谱-串联质谱法（LC-MS / MS）定量CD81+细胞中PGD2的含量以及释放到培养基中的PGD2水平，发现抑制Cox2显著降低PGD2的细胞水平和释放水平（图5G），表明Cox2是CD81+细胞合成PGD2所必需的。Cox1、Alox5和Alox12的抑制剂不干扰亚油酸的作用（图5H）。其次，鉴于CD81+细胞表达高水平的前列腺素受体，如DP1，作者确定PGD2直接作用于米色祖细胞的程度。另外还发现PGD2可以显著促进CD81+细胞的增殖，而DP1的特异性抑制剂MK-0524可以阻断PGD2的促增殖作用（图5I）。冷暴露显著增加腹股沟WAT中Ki67 + CD81 +细胞的数量；然而，Cox2抑制剂处理显著减弱冷暴露对CD81 +祖细胞增殖的刺激作用（图5J）。这些结果表明脂解衍生的亚油酸被线粒体中的CD81 +祖细胞氧化，并通过Cox2途径用于PGD2的合成。
图5 CD81+在线粒体代谢和花生四烯酸途径中富集
为解决米色祖细胞如何摄取亚油酸，作者首先在腹股沟WAT中寻找CD81+米色祖细胞相对于CD81-细胞高表达的细胞膜蛋白。转录组学数据鉴定出多个候选基因，包括Slc7a2（或称为Cat2）、Tmem37和Cd36（图6A）。
作者用qPCR（图6B）和CD36抗体（图6C）在独立样本中验证CD36与CD81、整合素b1或b2和SRC家族激酶类形成异源复合物，驱动CD36的内化。。接着，作者通过选择性敲除CD81+细胞（Cd81-CreERT2Cd36flox / flox小鼠，Cd36CD81 KO小鼠）中的CD36来验证CD36介导米色祖细胞摄取亚油酸的假说。Cd36CD81 KO小鼠和同窝对照在30℃下用他莫昔芬处理，然后逐渐适应8℃3天（图6D-E）。冷暴露3天后，发现Cd36CD81 KO小鼠腹股沟WAT中Ki67+ CD81 +细胞数量显著低于对照小鼠45 %（图6F-G）。组织学分析显示，与对照小鼠相比，Cd36CD81 KO小鼠腹股沟WAT中含有更少的多房UCP1 +米色脂肪细胞（图6H）。然而，由于Cd36CD81 KO小鼠腹股沟WAT中棕色/米色脂肪选择性基因的表达水平低于对照组（图6I），因此CD36缺失导致的米色脂肪生物合成受损是显著的。
在没有任何刺激的情况下，对照组和Cd36CD81 KO来源的CD81+细胞的增殖没有差异。然而，亚油酸诱导的Cd36CD81 KO小鼠CD81+细胞增殖明显减弱（图6J）。补充亚油酸后，Cd36CD81 KO小鼠腹股沟WAT中Ki67 + CD81 +细胞数量低于对照组小鼠（图6K）。在Cd36CD81 KO小鼠中，CD81 +细胞增殖减弱导致米色脂肪生物合成受损，因为冷和亚油酸补充对米色脂肪生物合成的加和作用被削弱（图6L）。此外，与对照组小鼠相比，Cd36CD81KO小鼠腹股沟WAT部位含有较少的多房米色脂肪细胞（图6M）。最后得出结论，病理生理棕色化刺激、冷习服、b3 - AR激活和烧伤促进米色脂肪新生（图7）。
图6 CD36是CD81+ APC增殖所必需的
图7米色脂肪生物生成的模型
参考文献：
Abe I, Oguri Y, Verkerke ARP, Monteiro LB, Knuth CM, Auger C, Qiu Y, Westcott GP, Cinti S, Shinoda K, Jeschke MG, Kajimura S. (2022). Lipolysis-derived linoleic acid drives beige fat progenitor cell proliferation. Dev Cell;57(23):2623-2637.e8. doi: 10.1016/j.devcel.2022.11.007.