ATF2抑制索拉非尼诱导的胃癌铁死亡
索拉非尼是一种酪氨酸激酶抑制剂，在包括胃癌(GC)在内的多种癌症中作为铁死亡诱导剂具有重要的抗肿瘤作用。然而，索拉非尼作为铁死亡诱导剂的地位最近受到了质疑。关于铁死亡与ATF2之间关系的信息非常有限，ATF2在索拉非尼诱导的铁死亡中的作用尚未被研究。在本研究中，我们研究了ATF2在索拉非尼诱导的胃癌铁死亡中的作用和潜在的分子机制。我们发现ATF2在胃癌组织中显著上调，预示着较差的临床预后。沉默ATF2可显著抑制GC细胞的恶性表型。此外，我们观察到ATF2在索拉非尼诱导的GC细胞铁死亡过程中被激活。ATF2敲低促进索拉非尼诱导的铁死亡，而ATF2过表达在GC细胞中显示相反的结果。通过ChIP-Seq和RNA-Seq，我们确定HSPH1为ATF2的靶点，并通过ChIP-qPCR分析进一步验证。HSPH1可以与SLC7A11相互作用，提高其蛋白稳定性。重要的是，HSPH1的下调部分逆转了ATF2过表达对索拉非尼诱导的GC细胞铁死亡的影响。此外，来自异种移植瘤模型的结果表明，ATF2的下调可以有效地增强索拉非尼在体内的敏感性。总的来说，我们的研究揭示了索拉非尼诱导GC铁死亡的一种新机制。本文于2022年12月发表于“Redox Biology”（IF=10.787）上。
结果
1）ATF2在胃癌中表达上调，预示预后不良
为了研究ATF2在胃癌中的表达模式，我们首先利用TCGA数据库。结果表明，ATF2 mRNA在GC组织中的表达明显高于正常组织(图1A)。ATF2在GC细胞系(SGC7901、HGC27、AGS、MGC803和MKN45)中的表达高于非恶性细胞系(GES-1；图1B)。另外，我们在12对新鲜GC组织和相邻正常组织中检测了ATF2蛋白的表达，也发现了相似的结果，ATF2在GC组织中表达增加(图1C)。我们还用免疫组化方法在包含107个GC组织和22个相邻正常组织的TMA上评估了ATF2的表达。不同ATF2表达水平的代表性图像如图1D所示。值得注意的是，61.7%(66/107)的GC组织中ATF2蛋白高表达，而63.6%(14/22)的相邻正常组织中ATF2蛋白低表达(图1E)。总生存期(OS)分析表明，ATF2表达升高的GC患者生存时间较ATF2表达降低的GC患者短(图1F)。同样，在一个大队列中验证了高ATF2表达与不良预后相关(图1G)。这些结果表明ATF2在GC中表达上调，是OS有价值的预测生物标志物。
2）ATF2表达下调可抑制GC细胞恶性表型
为了阐明ATF2在GC中的作用，我们通过一系列功能实验进行了进一步研究。首先，根据ATF2在GC细胞系中的表达水平，我们选择MGC803细胞系敲低ATF2，选择AGS细胞系过表达ATF2。qRT-PCR和western blot分析证实了ATF2下调和过表达的有效性(图2A和B)。CCK-8实验结果显示，ATF2下调显著降低了细胞增殖能力，但过表达ATF2没有明显影响(图2C和D)。如图2E所示，ATF2过表达显著增强了GC细胞的迁移能力，但对GC细胞的侵袭性没有影响。值得注意的是，ATF2下调显著降低了GC细胞的迁移和侵袭能力(图2F)。综上所述，这些结果表明，ATF2下调在体外对GC细胞恶性表型的影响要比ATF2过表达大得多。
3）索拉非尼诱导GC细胞铁死亡并激活ATF2表达
我们研究了索拉非尼是否诱导GC细胞铁死亡。如图3A所示，10 μM 索拉非尼作用24 h后，AGS和MGC803细胞形态均出现萎缩，呈圆形，排列松散。与对照组相比，索拉非尼治疗导致总细胞ROS和脂质ROS增加(图3B和C)。此外，索拉非尼处理导致MDA显著增加，但谷胱甘肽减少，Fer-1有效地抑制了这种效应(图3D和E)。考虑到铁死亡与线粒体功能密切相关，我们接下来研究了线粒体膜电位(MMP)和形态的变化。JC-1染色结果显示，与对照组相比，索拉非尼处理后MMP明显降低(图4A)。此外，TEM显示索拉非尼处理后MGC803细胞线粒体嵴明显减少或缺失，线粒体膜密度增加(图4B)。这些结果表明索拉非尼可诱导GC细胞铁死亡。作为一种关键的应激反应转录因子，ATF2在索拉非尼诱导的铁死亡中的表达变化尚不清楚。如图4C所示，索拉非尼治疗增加了ATF2的表达，尤其是磷酸化形式。免疫荧光显示，索拉非尼刺激后，ATF2在细胞核中表达更高(图4D)。因此，索拉非尼诱导的铁死亡可能促进ATF2核易位，增强ATF2在GC细胞中的转录活性。
4）ATF2下调增强索拉非尼诱导的GC细胞铁死亡
为了了解ATF2在索拉非尼诱导的铁死亡中的作用，我们调节ATF2表达水平并评估其对铁死亡的影响。我们发现，与载体细胞相比，ATF2过表达导致AGS细胞中索拉非尼的IC50值升高，而ATF2下调导致MGC803细胞中索拉非尼的IC50值降低(图5A)。索拉非尼处理和ATF2下调均使总细胞ROS和脂质ROS升高，ATF2下调导致AGS细胞进一步升高，而ATF2过表达抑制了MGC803细胞中索拉非尼诱导的升高(图5B和C)。同样，在索拉非尼处理的GC细胞中，ATF2过表达导致MDA减少，GSH增加，而ATF2下调则显示相反的结果(图5D和E)。透射电镜结果表明，在索拉非尼治疗后，ATF2下调的GC细胞线粒体减少，膜密度增加，嵴退化，这种作用被ATF2过表达部分逆转(图5F)。这些结果表明，ATF2过表达抑制了索拉非尼诱导的GC细胞铁死亡。
5）ATF2激活GC细胞中HSPH1的转录
为了进一步阐明潜在的机制，我们进行了RNA-seq和ChIP- seq来鉴定ATF2的全基因组DNA结合位点和潜在的转录靶点。如图6A所示，RNA-seq分析显示，与对照组相比，MGC803细胞在敲除ATF2后，上调了1059个基因，下调了370个基因。RNA-seq数据的通路富集分析表明，ATF2敲低显著影响了铁死亡通路(图6B)。接下来，ChIP-seq共鉴定出24119个峰，对应3641个RefSeq基因，其中2.88%位于启动子转录起始位点(图6C)。在染色体上观察到不同的峰值，并扫描峰值之间共享的motif(图6D和E)。我们将RNA-seq和ChIP-seq数据进行交集分析，筛选出了222个ATF2直接调控的候选转录靶点(图7A)，其中HSPH1在ATF2敲除后显著下调(图7B)。在TCGA数据集中，HSPH1在GC中的表达与ATF2呈显著正相关(图7C)。如图7D所示，ChIP-seq数据显示HSPH1启动子区(13号染色体位置31,162,322-31,162,573)存在显著的ATF2结合峰。因此，我们推测HSPH1可能是ATF2的潜在靶基因。western blot分析结果显示，过表达ATF2后HSPH1升高，敲低ATF2后HSPH1降低(图7E)，并且ChIP-qPCR进一步证实ATF2可以结合HSPH1的启动子区(图7F)。这些数据说明ATF2可以通过结合启动子激活HSPH1的表达。
6）GC中HSPH1与SLC7A11相互作用并增加其稳定性
鉴于热休克蛋白在铁死亡中的突出作用，我们试图确定HSPH1是否可能影响GC中SLC7A11的表达。我们首先查询GeneMANIA数据库，预测并显示了HSPH1与SLC7A11之间潜在的相互作用(图8A)。为了验证这一预测，我们进一步进行co-IP实验，确定HSPH1与SLC7A11存在物理相互作用(图8B)。接下来，我们用siRNA敲低HSPH1的表达(图8C)，并将HSPH1 siRNA转染到ATF2稳定过表达的AGS细胞中。有趣的是，我们观察到HSPH1的敲除降低了SLC7A11蛋白表达水平(图8D)。因此，我们进行了CHX追踪实验来表征在HSPH1敲除或不敲除情况下SLC7A11蛋白的半衰期。Western blot分析表明，与对照组相比，抑制HSPH1加速了AGS细胞中SLC7A11蛋白的降解(图8E)。这些结果表明，HSPH1可以与SLC7A11相互作用，并通过至少部分地增加SLC7A11蛋白的稳定性来增加其表达。接下来，我们发现HSPH1的下调部分消除了ATF2过表达对细胞ROS和脂质ROS的影响(图8F和G)。一致地，与HSPH1 siRNA共转染显著逆转了ATF2过表达对铁死亡中MDA和GSH水平的影响(图8H和I)。这些结果为ATF2通过HSPH1调节索拉非尼诱导的GC细胞铁死亡提供了证据。
7）ATF2下调增加GC在体内对索拉非尼的敏感性
为了评估单独下调ATF2和联合索拉非尼对体内GC的影响，建立裸鼠异种移植模型(图9A)。稳定的ATF2下调细胞形成的肿瘤始终比对照GC细胞形成的肿瘤更小、更轻，说明ATF2下调可有效抑制体内肿瘤的生长(图9B)。ATF2下调联合索拉非尼治疗后，皮下肿瘤的体积和重量均显著降低(图9C和图D)。为了更好地观察潜在的铁死亡，皮下肿瘤切片用脂质过氧化的敏感标记4-HNE染色。IHC染色显示sh-ATF2 +索拉非尼组4-HNE的表达最高(图9E)。因此，ATF2的下调增强了索拉非尼在体内对GC的抗肿瘤作用。
结论:我们发现索拉非尼激活ATF2的表达，并进一步促进HSPH1的表达，降低SLC7A11蛋白的降解，从而达到抗脂质过氧化的保护作用。我们研究证明促进索拉非尼诱导的铁死亡可能是一种有前途的GC治疗新策略。
参考文献：
Xu X, Li Y, Wu Y, Wang M, Lu Y, Fang Z, Wang H, Li Y. Increased ATF2 expression predicts poor prognosis and inhibits sorafenib-induced ferroptosis in gastric cancer. Redox Biol. 2022 Dec 2;59:102564. doi: 10.1016/j.redox.2022.102564.