PKM2的乳酸化抑制促炎巨噬细胞的炎症代谢适应

代谢适应是巨噬细胞表型转化的重要标志和前提。丙酮酸激酶M2 (PKM2)是促炎巨噬细胞代谢适应的重要决定因素。翻译后修饰在PKM2的调控中起核心作用。有研究首次报道了乳酸通过激活PKM2抑制Warburg效应，促进促炎巨噬细胞向修复表型的转变，该研究报告了PKM2的一种新的翻译后修饰类型，并阐明了其在调节促炎巨噬细胞的炎症代谢适应中的潜在作用。发表在《INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL SCIENCES》，IF:10.75。

技术路线：

主要研究结果：

1.PKM2调节LPS诱导的巨噬细胞的糖酵解

免疫细胞优先表达两种丙酮酸激酶异构体PKM1和PKM2，数据显示，naïve BMDM细胞中PKM2 mRNA的表达明显高于PKM1的表达(图1A)。100 ng/ml LPS孵育24小时后，PKM2的mRNA表达和蛋白水平显著增加，也显著高于25 ng/ml IL-4诱导的巨噬细胞(图1B, C)。虽然LPS诱导的巨噬细胞的PKM2蛋白水平显著高于naïve和IL-4诱导的巨噬细胞，但丙酮酸激酶活性并没有显著差异(图1D)。BMDM细胞裂解物的DSS交联表明，LPS诱导的巨噬细胞中四聚体形式的PKM2 (240KD)水平显著低于naïve和IL-4诱导的巨噬细胞(图1E)。与PKM2的四聚体形式不同，二聚体/单体形式可以进入细胞核，因此我们评估了PKM2的亚细胞定位。如图1F所示，LPS导致细胞核中PKM2的表达增加。通过免疫荧光，我们观察到LPS诱导的巨噬细胞胞核内PKM2的水平明显高于naïve和IL -4诱导的巨噬细胞(图1G)。这些结果表明PKM2在LPS诱导的巨噬细胞中过表达，但比在naïve和IL -4诱导的巨噬细胞中更无活性。结果表明，PKM2酶抑制剂(Pi;1.2μM Compound 3K)引起LPS孵育的巨噬细胞中糖酵解速率的显著增加(图1H, I)，但未导致OCR的变化(图1J)。基础OCR: ECAR比值表明，在LPS孵育的巨噬细胞中，降低PKM2丙酮酸激酶活性诱导代谢转变为较高的糖酵解(图1K)。这些结果表明，降低PKM2丙酮酸激酶活性增强了Warburg效应，促进了LPS孵育的巨噬细胞的炎症代谢适应。

图1PKM2调控脂多糖诱导巨噬细胞的糖酵解

2. 乳酸在LPS诱导的巨噬细胞中激活PKM2

PKM2调控糖酵解和乳酸生成;然而，乳酸是否调节PKM2仍不清楚。因此，我们首先检测了乳酸对BMDM细胞中PKM2 mRNA表达和蛋白水平的影响。结果表明，外源性乳酸(20mM)的干预既没有改变LPS诱导的巨噬细胞中PKM2的mRNA表达(图2A)，也没有改变PKM2的蛋白水平(图2B)。乳酸显著促进LPS诱导的巨噬细胞的丙酮酸激酶活性(图2C)。BMDM细胞裂解物的DSS交联表明，LPS-LA组的PKM2四聚体形式(240KD)水平显著高于LPS组(图2D)。免疫荧光结果显示，与LPS组相比，LPS-LA组细胞核中PKM2的表达明显降低(图2E, F)。这些结果表明，在LPS诱导的巨噬细胞中，乳酸激活了PKM2。

图2乳酸激活脂多糖诱导的巨噬细胞中的PKM2

3.乳酸抑制糖酵解，并通过激活PKM2促进LPS诱导的巨噬细胞向修复表型的转变

接下来，我们检测了乳酸对LPS诱导的巨噬细胞ECAR和OCR水平的影响。数据显示，乳酸显著降低了LPS孵育的巨噬细胞中的ECAR水平(图3A, B;LPS+LA组VS LPS组)。此外，我们观察到乳酸降低了OCR水平(图3C, D)。总体上，乳酸导致巨噬细胞的OCR: ECAR比值显著上调(图3E)。相比之下，PKM2酶抑制剂显著增加了ECAR水平(图3A, B;LPS+Pi组vs LPS组)，但没有改变OCR水平(图3C, D)，从而降低了OCR: ECAR比值(图3E)。PKM2酶抑制剂显著逆转了乳酸的作用。与LPS+LA组相比，LPS+LA+Pi组ECAR水平较高(图3A, B)，OCR: ECAR比值较低(图3E)。这些结果表明，乳酸可能通过激活PKM2来损害LPS诱导的巨噬细胞的炎症代谢适应。我们分析了乳酸是否通过激活PKM2促进LPS诱导的巨噬细胞向修复表型的转变。在BMDM细胞中，在LPS (100 ng/ml LPS)孵育48小时后，乳酸增加了ARG1水平，但降低了iNOS水平(图3F-H;LPS-LA组vs LPS-48组)。LPS-LA-pi组iNOS水平高于LPS-LA组，ARG1水平低于LPS-LA组(图3F-H)。这些结果支持乳酸通过激活PKM2部分促进LPS诱导的巨噬细胞向修复表型转化的理论。

图3乳酸抑制糖酵解并通过激活促进脂多糖诱导的巨噬细胞向修复表型的转变PKM2

4.乳酸促进伤口巨噬细胞向修复表型的转变，并通过激活PKM2加速小鼠伤口愈合

在本研究中，我们使用小鼠构建了皮肤伤口模型，以测试乳酸是否通过激活PKM2促进伤口巨噬细胞从促炎表型向修复表型的转变，并加速伤口愈合。伤后第5天，LA组创面组织中促炎巨噬细胞(iNOS+ CD68+阳性细胞)数量明显低于CTRL组，而修复性巨噬细胞(ARG1+ CD68+阳性细胞)水平高于CTRL组 (图4A、B)。与LA组相比，LA+Pi组中促炎巨噬细胞数量较高(图4A)，而修复性巨噬细胞数量较低(图4B)。愈合创面照片显示，LA组小鼠创面愈合速度明显快于CTRL组(图4C, D)，而LA+Pi组的创面愈合速度明显慢于LA组(图4C, D)。从数据可以看出，LA组在第9天的创面面积明显小于CTRL组(图4E)，而第9天LA+Pi组的创面面积明显大于LA组(图4E)。此外，伤后第5天的再上皮化也验证了创面愈合的速度。LA组移行上皮舌的长度明显长于CTRL组(图4F)，而LA+Pi组的长度显著短于LA组(图4F)。此外，伤后第12天，三组皮肤质量无显著差异(图4G)。这表明乳酸干预并没有降低伤口的愈合质量。综上所述，这些结果表明，在小鼠中，局部给予外源性乳酸促进了伤口巨噬细胞从促炎表型向修复表型的转变，并通过促进PKM2丙酮酸激酶活性加速了伤口愈合。

图4乳酸通过激活PKM2促进小鼠创面巨噬细胞向修复表型转化，加速创面愈合

5. 乳酸促进PKM2的K62乳酸化

在LPS诱导的BMDM细胞中，使用PKM2抗体下调PKM2，并使用抗lactylysine抗体检测PKM2的乳化水平。我们观察到PKM2被乳糖化修饰，20 mM乳酸处理24小时后，这一修饰显著增强(图5A)。IP质谱分析表明我们注意到4个位点(K62、K188、K224和K337)在乳酸干预后MS峰值强度增加最显著(图5B、C)，这表明这些位点对乳酸孵养更敏感。然后，通过过表达质粒在293T细胞中异位过表达标记的PKM2，我们构建了K62R、K188R、K224R和K337R位点突变或野生型PKM2过表达293T细胞。如图6D所示，与对照组相比，过表达PKM2的细胞中PKM2的水平明显上调。接下来，我们使用标志抗体拉低PKM2来检测泌乳水平。结果证实，K62R位点突变显著降低了PKM2的泌乳水平，而其他三个位点突变对泌乳水平无显著影响(图5E)。这些结果表明K62位点是PKM2的主要泌乳位点。PKM2的三级结构表明，K62位于PKM2蛋白的A结构域(图5F)，并且与关键活性位点S362相邻。如图5G所示，K62在从达尼奥到各种哺乳动物的物种中都是保守的。这些事实支持K62位点是PKM2功能的潜在调控位点的假设。

图5乳酸促进PKM2的K62乳酸化

6.K62R突变体逆转了乳酸对PKM2丙酮酸激酶活性和巨噬细胞表型转变的调节

我们进一步评估了K62位点乳酸化对PKM2功能的调节作用。如图6A所示，乳酸孵育显著促进了WT型PKM2过表达293T细胞中PKM2酶的活性。K62R突变显著抑制了乳酸培养后293T细胞中的PKM2酶活性(图6B;K62R-LA组vs WT-LA组)。乳酸孵育293T细胞的裂解产物的DSS交联表明，K62R-LA组的PKM2四聚体形式(240KD)水平显著低于WT-LA组(图6C)。此外，在乳酸孵育的293T细胞中，K62R-LA组细胞核中PKM2的水平约为WT-LA组的1.41倍(图6D)。这些结果证实了K62位点对PKM2的功能有明显的影响，并表明乳酸通过K62位点的泌乳部分促进PKM2酶的活性。接下来，我们使用慢病毒载体在BMDM细胞中过表达K62R突变或野生型PKM2。LPS孵育48小时后，乳酸增加了WT BMDM细胞中ARG1的水平，但降低了iNOS的水平(图6E-G;WT-LPS- la组vs WT-LPS组)。乳酸的这一作用在K62R突变的BMDM细胞中被显著削弱(图6E-G;K62R-LPS- LA组vsK62R-LPS组)。与WT-LPS-LA组相比，K62R-LPS-LA组显示出较高的INOS水平和较低的ARG1水平(图6E-G)。这些结果支持以下结论:乳酸通过K62位点PKM2的乳化，部分促进了LPS诱导的巨噬细胞向修复表型的转变。

图6K62R突变体逆转了乳酸对PKM2丙酮酸激酶活性和巨噬细胞表型转变的调节

结论：

综上所述，该研究首次确定了PKM2作为一种乳化底物。乳糖化增加PKM2的丙酮酸激酶活性，减少其四聚体到二聚体的转变和核分布。乳酸通过激活PKM2导致糖酵解减少，促进促炎巨噬细胞向修复表型的转变。