LncRNA ELF3-AS1通过与SNAI2形成负反馈环路抑制胃癌，并通过与ILF2/ILF3复合物相互作用调节ELF3 mRNA的稳定性

胃癌（GC）是癌症相关死亡的第三大常见原因。尽管GC的治疗已得到极大改善，但由于无法在早期诊断该癌症，生存率仍然很低。约1/3的GC患者被诊断为晚期转移，4-14%的患者有肝脏转移性疾病。由于GC转移通常以多发性和弥漫性分布为特征，绝大多数患者此时已失去手术治疗的机会。因此，迫切需要解开肿瘤转移的分子机制。越来越多的证据表明，SNAI2通过转录调节下游靶基因在驱动肿瘤转移中起关键作用，揭示SNAI家族的靶基因对于更好地了解肿瘤转移至关重要。ELF3-AS1是一种细胞周期相关的lncRNA，据报道lncRNA ELF3-AS1在肺癌中作为癌基因起作用。然而，ELF3-AS1在GC中的生物学功能尚不清楚。该研究发表于《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF: 12.658。

技术路线：

主要研究结果：

1. GC中转录阻遏因子SNAI2调控lncRNA的探索

为了探索SNAI2的靶基因，RNA测序研究（GSE161551）在过表达SNAI2的GC细胞系（SGC7901）中进行。共有318个编码基因，其中70个lncRNA被SNAI2强烈抑制，55个编码基因和53个lncRNA被SNAI2大幅上调。如图1A所示，IGFBP1/3、ITGB4、CLDN1/4、TJP3、EFNA1、KRT80、ELF3等的表达受到SNAI2的强烈抑制，而CYR61、CTGF、IL11、ID2/3、RBM3、THBS1等的表达受到SNAI2的强烈上调。类似地，大约123个lncRNA，包括linc01315，MIR210HG，FZD10-DT，linc00963，HOXB-AS3，LUCAT1，ITPR1-DT，PDCD4-AS1，ZNF197-AS1等，在过表达SNAI2后极大地改变了它们的表达。有趣的是，反义lncRNA ELF3-AS1及其邻近基因ELF3都被SNAI2强烈抑制（图1B)。

为了进一步确认ELF3-AS1和ELF3是否可能受到SNAI2的负调节，在两个GC细胞系中进行了关于SNAI2的功能丧失和功能获得研究。正如预期的那样，ELF3-AS1和ELF3在SNAI2过表达细胞系中显著下调，但在SNAI2去除细胞系中显著上调（图1C-E）。这些结果表明，在GC中，SNAI2对ELF3-AS1和ELF3均呈负调控。

ELF3-AS1是上皮肿瘤抑制基因ELF3的反义lncRNA。启动子分析显示，ELF3-AS1启动子含有一个序列“GGTACAGGTGGGT”，预测被SNAI2和SNAI1识别。该序列位于ELF3-AS1转录起点上游829 bp，这也是ELF3基因外显子2和内含子2之间的连接点（图1F）。因此，作者推测ELF3-AS1和ELF3可能受到SNAI2和SNAI1的转录调控。

图1 通过RNA-seq鉴定GC中SNAI2调控的lncRNA

2. ELF3-AS1和ELF3被SNAI2和SNAI1转录抑制

LncRNA ELF3-AS1在人体细胞中含量丰富，在RNA测序时可被磁珠有效捕获。为了使作者的结果更具说服力，作者使用RNA-seq研究来可视化ELF3-AS1和ELF3的表达。正如预期的那样，RNA-seq分析和qRT-PCR测定共同表明ELF3-AS1和ELF3被SNAI2 / SNAI1过表达下调（图2A-F）。此外，SNAI2对ELF3和ELF3-AS1表达的抑制强度远大于SNAI1（图2B，E）。

此外，为了确定SNAI2/SNAI1是否在转录水平上抑制ELF3 / ELF3-AS1，在SNAI1和SNAI2过表达细胞系中进行双荧光素酶和CHIP测定。如图2G所示，当SNAI1/2结合序列发生突变时，SNAI1/2过表达对荧光素酶表达的强烈抑制部分恢复，提示该序列是SNAI1/SNAI2抑制ELF3/ELF3-AS1表达所必需的。另一方面，CHIP测定表明SNAI1和SNAI2可以直接与ELF3-AS1启动子结合（图2H-J）。综上所述，SNAI2和SNAI1都参与了GC中ELF3和ELF3-AS1的转录调控。

图2 ELF3-AS1和ELF3在GC中被SNAI2和SNAI1转录抑制

3. ELF3-AS1和ELF3表达降低预示GC预后不良

由于ELF3和ELF3-AS1被EMT相关转录因子SNAI1/2抑制，作者进一步进行了ELF3/ELF3-AS1与EMT生物标志物的基因表达相关性分析。正如预期的那样，ELF3和ELF3-AS1都与上皮生物标志物高度共表达（图3A)。

此外，对30对GC组织中ELF3-AS1表达的分析表明，与相应的正常样品相比，ELF3-AS1在超过80%的GC样品中下调（图3B）。另一方面，作者分析了癌症基因组图谱（TCGA，n = 375）数据库中GC样本中ELF3-AS1下调的临床意义。LncRNA ELF3-AS1在弥漫性和低分化的GC组织中表达低（图3C和D）。总生存期分析表明，ELF3-AS1表达水平较低的GC患者总生存时间较短（图3E，p=0.029）。

作者之前的研究暗示ELF3在GC中起肿瘤抑制作用。在此，作者进一步确认了ELF3在GC中的表达显著下调（图3F，G）。此外，与肠道GC相比，在弥漫性GC中观察到ELF3的表达较低（图3H）。3ELF3的低表达与GC的恶性进展呈正相关（图3I，J）。ELF3表达较低的GC患者总生存时间和无病生存时间较差GSE62254GC队列（图3K）。临床分析与作者的发现非常吻合，即ELF3-AS1和ELF3在GC中被SNAI2和SNAI1转录抑制。

图3 ELF3-AS1和ELF3表达降低与GC预后不良相关

4. 上皮转录因子ELF3在GC中发挥肿瘤抑制作用

反义lncRNA通常与其相邻的蛋白质编码基因高度共表达。同样，作者还观察到ELF3-AS1和ELF3在正常胃组织，GC细胞系和泛组织中存在高共表达（图4A-E）。有趣的是，当ELF3-AS1在GC细胞系中被有效敲低时，ELF3 mRNA及其蛋白质显著降低至约60-70%（图4F-I）。然而，目前尚不清楚ELF3-AS1如何影响GC中的ELF3表达。

此外，对30对GC组织中ELF3-AS1表达的分析表明，与相应的正常样品相比，ELF3-AS1在超过80%的GC样品中下调（图3B）。另一方面，作者分析了癌症基因组图谱（TCGA，n = 375）数据库中GC样本中ELF3-AS1下调的临床意义。LncRNA ELF3-AS1在弥漫性和低分化的GC组织中表达低（图3C和D）。总生存期分析表明，ELF3-AS1表达水平较低的GC患者总生存时间较短（图3E，p=0.029）。

作者之前的研究暗示ELF3在GC中起肿瘤抑制作用。在此，作者进一步确认了ELF3在GC中的表达显著下调（图3F，G）。此外，与肠道GC相比，在弥漫性GC中观察到ELF3的表达较低（图3H）。ELF3的低表达与GC的恶性进展呈正相关（图3I，J）。ELF3表达较低的GC患者总生存时间和无病生存时间较差GSE62254GC队列（图3K）。临床分析与作者的发现非常吻合，即ELF3-AS1和ELF3在GC中被SNAI2和SNAI1转录抑制。

5. 上皮转录因子ELF3在GC中发挥肿瘤抑制作用

反义lncRNA通常与其相邻的蛋白质编码基因高度共表达。同样，作者还观察到ELF3-AS1和ELF3在正常胃组织，GC细胞系和泛组织中存在高共表达（图4A-E）。有趣的是，当ELF3-AS1在GC细胞系中被有效敲低时，ELF3 mRNA及其蛋白质显著降低至约60-70%（图4F-I）。然而，目前尚不清楚ELF3-AS1如何影响GC中的ELF3表达。

鉴于ELF3属于ETS转录因子家族，作者最初假设ELF3-AS1和ELF3的共表达可能是由于ELF3调节ELF3-AS1的表达。为了验证这种可能性，在两个GC细胞系中进行了关于ELF3的功能丧失和功能获得研究。然而，在GC中敲低或过表达ELF3后，ELF3-AS1的表达没有显著改变（图4J和K）。尽管转录因子ELF3不能调节ELF3-AS1的表达，但划痕伤口愈合测定和Transwell测定证实ELF3在GC细胞迁移和侵袭中具有肿瘤抑制作用（图4L和M）。

图4 ELF3负调节细胞转移，但不能调节GC中ELF3-AS1的表达

6. ELF3-AS1主要通过抑制SNAI2信号传导抑制GC转移

作者通过miRNA测序分析了ELF3-AS1敲低后差异表达的miRNA（图5A）。令人惊讶的是，在ELF3-AS1耗竭大幅下调的前10种miRNA中，miR-33a，miR-33b和miR-203a是众所周知的靶向SNAI2的miRNA（图5B）。为了确认miRNA测序的可靠性，作者检查了ELF3-AS1去除细胞系中miR-33a，miR-33b和miR-203a的表达水平。结果表明，ELF3-AS1敲低确实能显著降低miR-33a、miR-33b和miR-203a的表达（图5C-E）。相应地，ELF3-AS1的耗竭导致SNAI2 mRNA和蛋白质的显著上调（图5F-H）。一致地，分析来自另一项独立研究的RNA-seq数据（GSE92250）还表明ELF3-AS1敲低导致A549和Hela细胞系中的SNAI2 mRNA上调（图5I），表明ELF3-AS1对SNAI2表达的负调控可能在癌症中广泛存在。

基于上述发现，作者推测ELF3-AS1可能通过抑制SNAI2信号传导来抑制GC进展。为了验证这种可能性，在体内和体外进行了救援测定。敲低SNAI2表达挽救了ELF3-AS1去除的GC细胞系的致瘤特性（图5J和K）。这些数据强烈表明，ELF3-AS1主要通过抑制SNAI2信号传导来抑制GC细胞的迁移和侵袭。

图5ELF3-AS1主要通过抑制SNAI2信号传导来抑制GC转移

7. 核定位的lncRNA ELF3-AS1在细胞周期进程中起关键作用。

lncRNA的生物学功能与其亚细胞位置密切相关。ELF3-AS1是GC中的核定位lncRNA（图6A和B）。之前的一项研究报道，ELF3-AS1是一种细胞周期相关的lncRNA。作者的研究还表明，lncRNA ELF3-AS1在细胞周期进程中起着至关重要的作用。ELF3-AS1敲低显著加速了GC中细胞周期的G1/S转变（图6C和D）。有趣的是，RNA-seq分析表明，敲低ELF3-AS1导致几乎所有组蛋白编码基因的显著上调超过2倍（图6E和F）。众所周知，组蛋白的合成发生在细胞周期的S期，与DNA复制同步。这些结果表明，ELF3-AS1通过影响G1/S转换和组蛋白合成来负调节GC细胞的细胞周期进程。

为了更好地理解ELF3-AS1调控细胞周期过程的分子机制，作者分析了ELF3-AS1敲低后细胞周期相关基因的表达变化。结果表明，敲低ELF3-AS1增加了GC中CDK6和CASP7的表达，但降低了CDKN1A（也称为p21）的表达（图6G和H）。p21蛋白作为G1/S转变的细胞周期检查点。CDK6/CCND1蛋白复合物对细胞周期G1相进展和G1/S转变非常重要。因此，ELF3-AS1敲低引起的G1/S转变的促进可能是由于P21的下调和CDK6的上调.

图6 核定位的lncRNA ELF3-AS1通过影响G1 / S过渡和组蛋白合成来调节细胞周期进程

8. ILF2/ILF3复合物可直接调节ELF3-AS1/ELF3 RNA双链体的稳定性

通过RNA下拉分析鉴定了与lncRNA ELF3-AS1相互作用的潜在蛋白质。根据位于45道尔顿处的差分带的质谱（MS）分析（图7A），有7种蛋白质匹配覆盖率大于20%。在这些蛋白质中，RINI，ILF2（也称为NF45）和TARBP2是双链RNA（dsRNA）结合蛋白（图7B）。有趣的是，另一种名为ILF3的蛋白质（也称为NF90 / NF110）也出现在该条带的MS结果中（图7C）。作者随后的蛋白质印迹测定进一步验证了ILF2，ILF3和TARBP2可以与外源性lncRNA ELF3-AS1结合（图7D）。此外，CHIRP下拉试验证实内源性ELF3-AS1也与ILF2和ILF3蛋白结合（图7E和F）。维恩图显示，在三个MS结果的交点处显示了大约22种蛋白质，包括ILF2，ILF3，RINI等（图7F）。为了弄清楚ELF3-AS1转录本的哪个区域可以与ILF2和ILF3相互作用，作者截断了不同长度的ELF3-AS1转录本。在通过蛋白质印迹分析了不同长度的ELF3-AS1转录本拉下的蛋白质后，作者发现第一个外显子区域对于ELF3-AS1转录本与ILF2 / ILF3复合物之间的相互作用是必需的（图7G）。此外，作者在转染不同长度的ELF3-AS1转录本的GC细胞中检测到ELF3表达。结果表明，仅过表达含有外显子1的ELF3-AS1转录本上调ELF3表达（图7H）。RNA免疫沉淀测定显示，与ILF2和ILF3蛋白结合的ELF3-AS1转录本比对照IgG组高数千倍（图7I，J）。

图7 ELF3-AS1直接与ILF2 / ILF3蛋白复合物相互作用

由于选择性剪接，ELF3基因具有不同的转录本。在这些不同类型的ELF3转录本中，ELF3-201，ELF3-202和ELF3-203可以编码全长ELF3蛋白。ELF3-201转录本和ELF3-AS1转录本重叠约664个核苷酸（图8A）。换句话说，ELF3-AS1可以与ELF3-201的第一外显子区结合形成双链RNA分子。另一方面，RNA-seq分析表明，与ELF3-203或任何其他ELF3转录本水平相比，ELF3-AS1的敲低对ELF3-201表达的影响更深远（图8B）。这些数据暗示ILF2 / ILF3复合物可能与ELF3-AS1和ELF3-201形成的dsRNA结合。为了进一步验证这种可能性，作者还检查了ILF2 / ILF3的RIP测定中的ELF3-201转录本水平。与ILF2和ILF3结合的ELF3-201转录本远高于对照IgG组（图8C，D），表明ILF2 / ILF3复合物可以与ELF3-AS1和ELF3-201形成的dsRNA结合。

据报道，ILF2/ILF3复合物在调节mRNA稳定性中起重要作用。RNA-seq数据和qPCR检测表明，ILF3的敲低显著降低了ELF3-AS1和ELF3-201的mRNA水平，而ILF2的敲低显著提高了ELF3-AS1和ELF3-201的mRNA水平（图8E-G）。这些结果表明，ILF2和ILF3蛋白对ELF3-AS1转录本的稳定性具有相反的影响。先前的一项研究报道，NF45在ILF2/ILF3复合物中作为调节亚基起作用。有趣的是，作者还注意到ILF2的敲低可能会影响ILF3基因的选择性剪接（图8H）。因此，推测ILF2可能通过影响ILF3基因的选择性剪接来调控ELF3-AS1和ELF3-201的表达。

图8 ILF2/ILF3与ELF3-AS1/ELF3 RNA双链体相互作用，影响RNA双链体的稳定性

结论：

综上所述，在GC中发现了SNAI2和lncRNA ELF3-AS1之间新的双负反馈环。SNAI2-ELF3-AS1反馈环通过连续激活SNAI2信号传导并在转录和转录后水平调节ELF3表达来驱动GC转移。在GC中，SNAI2过表达，导致ELF3和ELF3-AS1的表达水平降低。反过来，ELF3-AS1下调通过持续激活SNAI2信号传导和促进细胞增殖进一步推动肿瘤进展，从而导致GC预后不良。

参考文献：

Li D, Shen L, Zhang X, Chen Z, Huang P, Huang C, Qin S. LncRNA ELF3-AS1 inhibits gastric cancer by forming a negative feedback loop with SNAI2 and regulates ELF3 mRNA stability via interacting with ILF2/ILF3 complex. J Exp Clin Cancer Res. 2022 Dec 2;41(1):332. doi: 10.1186/s13046-022-02541-9.