外泌体CircATG4B编码的新蛋白通过促进自噬诱导结直肠癌奥沙利铂耐药
奥沙利铂是结直肠癌（CRC）手术后常用的化疗方案。然而，获得性耐药严重影响CRC患者的疗效，其机制尚不清楚。本文鉴定circRNA circATG4B在结直肠癌奥沙利铂耐药中起重要作用。并发现circATG4B通过促进自噬诱导奥沙利铂耐药。此外，circATG4B的作用归因于其编码一种新型蛋白质circATG4B-222aa的潜力。进一步研究发现circATG4B-222aa作为诱饵，和TMED10竞争与ATG4B的相互作用，导致自噬增加，随后诱导耐药。因此，本研究揭示外泌体circATG4B参与CRC细胞化疗敏感性的降低，为CRC奥沙利铂耐药的潜在治疗靶点提供新的理论依据。本研究于2022年12月9日发表于《AdvSci (Weinh)》，IF：17.521
技术路线：
主要研究结果：
越来越多的证据证明circRNA参与宿主基因的功能。基于在线数据库circBase，作者评估15种源于ATG4B的circRNA的表达，发现hsa_circ_0 007159 （circATG4B）在奥沙利铂耐药患者CRC组织中显著上调（图1A），与细胞表达状态一致（图1B）。以cDNA和基因组DNA（gDNA）为模板，对PCR产物进行电泳验证，结果表明，扩增的cDNA中只有预期大小的产物，而gDNA中没有（图1C）。此外，Sanger测序证实扩增的circATG4B头尾剪接，提示circATG4B来源于ATG4B基因的外显子，这与circBase中circATG4B数据是一致的（图1D）。与线性形式相比，circATG4B具有较长的半衰期，并对RnaseR处理具有抗性（图1E-F），进一步说明circATG4B确实以环状形式存在。FISH结果显示circATG4B主要定位在细胞质中，在耐奥沙利铂CRC细胞中比敏感细胞中含量高的多（图1G）。接着，作者评估几种奥沙利铂耐药细胞系和匹配的CRC细胞中的circATG4B水平。与这些结果一致的是，circATG4B在奥沙利铂耐药细胞系显著高表达（图1H）。Kaplan - Meier生存分析显示，在circATG4B低表达的患者中，接受奥沙利铂治疗的患者无病生存期（DFS）显著长于对照组（图1I）。相反，在circATG4B水平较高的患者中，奥沙利铂治疗组与对照组的DFS时间无差异（图1J）。此外，作者发现奥沙利铂治疗仅在circATG4B低表达的患者中是独立的预后因素，而在circATG4B高表达的患者中则不是（表1）。此外，在接受奥沙利铂治疗的队列中，与circATG4B低表达的患者相比，circATG4B高表达的患者有更差的DFS（图1K）。这些结果表明circATG4B与CRC细胞对奥沙利铂的反应密切相关。
图1 circATG4B在奥沙利铂相关CRC细胞过表达
表1
2、外泌体转移的circATG4B诱导奥沙利铂耐药
作者猜想circATG4B可能从奥沙利铂耐药CRC细胞通过外泌体转移到奥沙利铂敏感细胞。为证明这个猜想，作者从耐奥沙利铂CRC细胞上清中分离出外泌体，经电镜鉴定为典型的具有双层膜的圆形颗粒（图2A）。NTA（纳米颗粒追踪分析）发现颗粒大小（图2B）。图2C展示外泌体外泌体因子CD45，CD9和Annexin的表达。qRT-PCR显示，circATG4B在奥沙利铂耐药CRC细胞系中明显上调，尤其是在HCT116-L-OHP和SW480-L-OHP细胞系衍生的外泌体中上调（图2D），与细胞表达水平一致。当CRC细胞与来自奥沙利铂耐药CRC细胞的外泌体（PKH26标记）共培养时，在受体细胞中观察到大量外泌体（红色），表明CRC细胞具有较高的外泌体摄取效率（图2E）。在与分离的外泌体或PBS在母本细胞中孵育后，作者发现circATG4B由于与用si-NC或不使用si-NC处理的奥沙利铂耐药细胞的外泌体共培养而显著上调，当外泌体的circATG4B被siRNA击杀后，这一现象被逆转（图2F）。
假定外泌体circATG4B来源于奥沙利铂耐药细胞，作者进一步研究其对化疗耐药的影响。作者的结果展示与exo-si-NC相比，共孵育exo-si-circATG4B增加CRC细胞中奥沙利铂对小鼠细胞凋亡的抑制率和诱导率（图2G-H）。为探索体内外泌体circATG4B的作用，采用皮下注射HCT116细胞建立小鼠异种移植模型。每4天测量一次肿瘤的大小，16天后处死所有的小鼠（图2I）。exo-si- NC处理的肿瘤的生长率和肿瘤重量均高于外源性exo-si-circATG4B或PBS处理的肿瘤（图2J-L）。这表明CRC中外泌体circATG4B对奥沙利铂的敏感性降低。以上结果说明外泌体转移的circATG4B诱导奥沙利铂耐药。
图2外泌体转移的circATG4B诱导奥沙利铂耐药
3、外泌体CircATG4B提高奥沙利铂抗药过程的活性
自噬在化疗耐药中起着重要的作用，因此作者测量抗奥沙利铂细胞和亲代细胞的自噬水平。值得注意的是，在奥沙利铂耐药细胞中观察到LC3B-II/I的比例高于相应的亲本细胞（图3）。为确定自噬是否对奥沙利铂耐药至关重要，作者用雷帕霉素（RAPA，自噬诱导物）处理CRC细胞，发现RAPA治疗诱发药物耐药（图3B）。相反，作者发现3-MA（甲基腺嘌呤），一种常见的自噬抑制剂，增加耐药CRC细胞对奥沙利铂的敏感性（图3C），进一步表明自噬在奥沙利铂耐药中起重要作用。此外，作者发现用外对照处理的CRC细胞比用PBS处理的细胞表现出更高的耐药性，并且这种化学耐药性在用PBS处理后大大逆转（图3D），表明外泌体可能通过调节自噬，促进从药物敏感到耐药的转变。转染circATG4B过表达质粒的CRC细胞化疗耐药性增加。然而，3-MA处理逆转这种效应(图3E )，表明circATG4B可以通过自噬诱导化疗耐药。此外，作者探究外泌体circATG4B在自噬过程中的作用。用奥沙利铂耐药的CRC细胞分泌的多种外泌体处理后，在受体细胞系HCT116和SW480中进行一系列实验。免疫荧光（IF）染色结果显示，exo-si-NC预处理的CRC细胞中自噬小体形成显著增加，而circATG4B水平降低的外泌体预处理的CRC细胞中绿色斑点数量减少（图3F）。此外，TEM分析显示，exo-si-NC预处理后自噬体数量增加，而exo-sio-circATG4B预处理后自噬体数量明显减少（图3G）。此外，与PBS处理相比，转染si - NC的奥沙利铂耐药结直肠癌细胞分泌的外泌体处理显著促进LC3B - I到II的转化，而当外泌体circATG4B被敲低时，LC3B - II积累被抑制（图3H）。此外，在前期建立的异种移植小鼠模型中IHC结果显示，与exo-si-NC组相比，exo-si-circATG4B处理的CRC细胞中p62的表达水平显著升高，LC3B和Ki67（细胞增殖的标志物）的表达水平降低（图3I），进一步证实外泌体circATG4B通过调节自噬诱导奥沙利铂耐药。
图3外泌体circATG4B促进自噬水平
4、CircATG4B编码一种新的222氨基酸（aa）蛋白，CircATG4B-222a
RIP结果显示circATG4B与AGO2不相关（图4A），提示circATG4B可能通过不同的机制行使其功能。查阅circ RNA Db中的注释，作者发现circATG4B有一个669 nt的开放阅读框（ORF），具有编码222个氨基酸蛋白的潜力（图4B）。在circATG4B的ORF中，circRNA序列中串联的' AUG '密码子可以启动新蛋白的翻译，而终止密码子' UAG '可以终止翻译。包含有33个特异性氨基酸的新序列命名为' circATG4B-222aa '（图4C）。
由于circRNA没有5′- cap序列，可以启动蛋白质翻译，因此需要一个内部核糖体进入位点（IRES）。作者在ORF中发现一个IRES，并通过双荧光素酶实验验证circATG4B中IRES的活性（图4D-E）。为确认circATG4B - 222aa的存在，研究构建4个带有不同flag标签的载体，并将其克隆到CMV诱导表达载体中（图4F）。在转染circATG4B - flag载体或circATG4B - flag - mut载体的CRC细胞中，circATG4B的表达明显上调。与转染空载体相比，转染circATG4B - 222aa载体并未明显改变circATG4B的表达（图4G）。这4种载体均不影响线性ATG4B mRNA水平。此外，ATG4B的表达不受4种载体的影响（图4H）。最后，通过SDS - PAGE分离转染circATG4B和空载体的HEK - 293T细胞总蛋白，切取大小约为24 kD的蛋白条带进行LC - MS / MS分析，成功鉴定出circATG4B剪接连接处形成的独特肽段序列，表明circATG4B能够编码一种新的蛋白（图4I）。此外，circATG4B - 222aa在化疗耐药的CRC细胞系中表达明显升高（图4J）。将带有鞭毛的circATG4B - 222aa转染至HCT116细胞后，使用抗鞭毛抗体进行免疫荧光染色以鉴定circATG4B-222aa的细胞质定位（图4K）。最后，circATG4B - 222aa表达与接受奥沙利铂治疗的CRC患者的不良预后呈正相关，表明circATG4B - 222aa可能是奥沙利铂耐药的预后标志物（图4L）。
图4 circATG4B编码能力的评价
5、CircATG4B-222aa而非CircATG4B增加体内CRC细胞自噬并诱导奥沙利铂耐药
为探究circATG4B - 222aa的生物学功能，将上述4种带不同flag标签的载体转染CRC细胞系。转染circATG4B或circATG4B - 222aa过表达载体后，LC3B的点状聚集数量、自噬体形成和LC3B - I / II的转换均显著增加（图5A-C）。而转染circATG4B - mut载体的CRC细胞无明显变化，推测其无法启动circATG4B - 222aa的翻译。这些结果表明，仅过表达circATG4B - 222aa可增加自噬水平。有趣的是，过表达circATG4B - 222aa降低奥沙利铂敏感性和奥沙利铂诱导的细胞凋亡。而过表达突变体circATG4B对这些现象无明显影响（图5D-E）。为进一步探讨circATG4B - 222aa在体内的作用，通过皮下注射稳定转染不同circATG4B载体的HCT116细胞建立异种移植小鼠模型。每4 d测量一次肿瘤的大小，circATG4B和circATG4B - 222aa组的生长速度和肿瘤重量均大于vector对照组和circATG4B - mut组（图5F-H）。检测裸鼠移植瘤中LC3B、p62和Ki67的表达。IHC结果显示，与对照组和circATG4B - mut组相比，circATG4B和circATG4B - 222aa组中LC3B和Ki67的表达水平显著升高，p62的表达水平显著降低（图5I）。总之，这些结果表明circATG4B-222aa而不是circATG4B增加CRC细胞的自噬并诱导奥沙利铂耐药。
图5 CircATG4B-222aa而非CircATG4B增加体内CRC细胞自噬并诱导奥沙利铂耐药
6、CircATG4B-222aa防止ATG4B的影响TMED10介导的抑制
为探索circATG4B - 222aa在自噬中的潜在作用机制，将带有鞭毛的circATG4B - 222aa质粒转染至HEK - 293T细胞中，免疫共沉淀和质谱分析检测circATG4B - 222aa潜在的相互作用蛋白。作者对差异表达蛋白进行鉴定（图6A），发现在识别蛋白的排序列表中丰度最高的蛋白为TMED10（图6B）。因此，推测TMED10是circATG4B - 222aa的潜在靶点。此外，进一步的实验证实circATG4B - 222aa在CRC细胞中确实与TMED10存在相互作用（图6C）。在HCT116细胞中转染带有flag标签的circATG4B - 222aa，免疫荧光染色也表明circATG4B - 222aa与TMED10存在共定位（图6D）。
为探究TMED10与circATG4B - 222aa相互作用的结构域，作者构建一系列带有GFP标签的TMED10缺失突变体（图6E）。TMED10的LD - only突变体与circATG4B - 222aa不结合，表明TMED10的TD和CD都是TMED10与circATG4B - 222aa相互作用所必需的（图6F）。通过对circATG4B - 222aa的带有flag标签的截短突变体进行Co - IP分析，作者也鉴定circATG4B - 222aa参与TMED10 - circATG4B - 222aa相互作用的区域（图6G）。circATG4B-222aa ( aa1 - 111)和circATG4B - 222aa ( aa112 ~ 222)的截短体均可被TMED10拉下（图6H），表明全长circATG4B - 222aa与TMED10存在相互作用。
在进一步的研究中，作者发现circATG4B - 222aa的表达增加LC3B - I / II的转换，但两个截短突变体均不能（图6I），表明全长circATG4B - 222aa负责自噬过程。Co - IP结果表明，过表达circATG4B - 222aa削弱TMED10与ATG4B的相互作用（图6J），表明circATG4B - 222aa导致ATG4B与TMED10解离。作者进一步在CRC细胞中验证TMED10与circATG4B - 222aa的相互作用。在CRC细胞中，增加circATG4B - 222aa水平通过激活ATG4B增强GLUC连接的LC3的切割（图6K）。这些结果表明circATG4B - 222aa可能作为TMED10的诱饵，逃避TMED10诱导的ATG4B抑制。
图6 CircATG4B-222aa防止ATG4B的影响TMED 10介导的抑制
7、在奥沙利铂耐药的CRC细胞中，CircATG4B – 222aa逆转TMED10诱导的化疗敏感性
随后，作者评估circATG4B - 222aa与TMED10的相互作用在奥沙利铂耐药中的功能。circATG4B - 222aa逆转TMED10诱导的CRC耐药细胞凋亡和化疗敏感性的增加（图7A-B）。为进一步研究circATG4B - 222aa与TMED10在体内的功能联系，将稳定转染不同质粒的耐药结直肠癌细胞移植瘤小鼠于第16天给予奥沙利铂治疗。过表达TMED10细胞组的肿瘤生长和重量均显著下降，而过表达circATG4B - 222aa逆转这种抑癌作用（图7C-E）。这些结果表明circATG4B - 222aa可以通过与TMED10相互作用并增加自噬活性来诱导奥沙利铂耐药（图7F）。
图7在奥沙利铂耐药的CRC细胞中，Circatg4B - 222Aa逆转Tmed10诱导的化疗敏感性
结论:
综上所述，研究发现奥沙利铂耐药的CRC细胞来源的上调的外泌体circATG4B可以转移到受体细胞中，从而在受体细胞中诱导奥沙利铂耐药。此外，circATG4B编码一个新的功能蛋白（circATG4B-222aa）。circATG4B-222aa在体内外均可促进CRC细胞自噬并诱导奥沙利铂耐药，但circATG4B本身并不促进自噬。此外，circATG4B - 222aa与TMED10存在竞争性相互作用，并作为诱饵阻止TMED10与ATG4B结合，导致自噬增加并诱导耐药。总之，本研究证明circRNA在CRC耐药获得中的新机制。新型circATG4B - 222aa是重要的生物标志物，可能作为奥沙利铂耐药CRC的潜在治疗靶点。
参考文献
Pan Z, Zheng J, Zhang J, Lin J, Lai J, Lyu Z, et al. (2022) A Novel Protein Encoded by Exosomal CircATG4B Induces Oxaliplatin Resistance in Colorectal Cancer by Promoting Autophagy. AdvSci (Weinh);9(35):e2204513. doi: 10.1002/advs.202204513.