LncRNA CEBPA-DT通过与hnRNPC相互作用激活DDR2/β-catenin从而促进肝癌转移

原发性肝癌（PLC）是第六大最常见的人类癌症类型，在全球癌症死亡率中排名第三。肝细胞癌（HCC）是肝癌的主要组织学类型，约占PLC的90%。尽管在检测和治疗方面不断改善，但由于肝细胞癌患者进展迅速，术后肿瘤复发和转移的患病率高，HCC患者的远期结局仍然较差，5年总生存率低于30%。因此，阐明HCC生长和进展的分子机制以确定新的治疗靶点至关重要。长非编码RNA CEBPA-DT是CCAAT增强子结合蛋白α（CEBPA）基因的不同转录本，已被证明参与多种肿瘤进展。然而，还没有研究在HCC中建立其促癌机制。该研究发表于《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF: 12.658。

技术路线：

主要研究结果：

1. CEBPA-DT在肝细胞癌组织中上调，与患者预后相关

为了筛选与肝细胞癌转移相关的lncRNA，采用RNA-seq分析术后肝外转移患者的11个HCC组织和未发生转移或复发的患者的11个HCC组织之间的差异表达基因，鉴定出320个显著改变的lncRNA（图1A）。6个lncRNA（CEBPA-DT，编号：AL136372，MEG3，DBH-AS1，TUG1，PSMA3-AS1）在肝外转移患者的11个HCC组织中具有最高的丰度（平均FPKM > 5）。CEBPA-DT被选为进一步研究的候选lncRNA，因为它是在前面提到的6个候选lncRNA中（图1B，C）最显著的上调靶标（log2（倍数变化）= 5.753，P = 0.013）。此外，研究者检查了CEBPA-DT在54个具有相应正常肝组织的肝细胞组织中的表达水平。RT-qPCR分析表明，肝癌组织中CEBPA-DT的表达显著高于配对正常肝组织中的表达（图1D）。在TCGA LIHC数据中的50对肝细胞癌和正常组织中也观察到了类似的结果（图1F）。

为了进一步评估HCC患者中CEBPA-DT表达水平的预后价值，在88个HCC组织中测量了CEBPA-DT的表达水平。患者分为高CEBPA-DT组（n=44）和低CEBPA-DT组（n=44），符合CEBPA-DT在HCC组织中的表达。较高的CEBPA-DT表达水平与血清甲胎蛋白（AFP）水平升高、肿瘤体积较大、肿瘤分化差和微血管浸润（MVI）显著相关，提示CEBPA-DT表达较高与肝细胞癌生长和转移有关。Kaplan-Meier生存曲线表明，高CEBPA-DT水平组的HCC患者与低水平CEBPA-DT患者的总生存期（OS）和无复发生存期（RFS）显著相关（图1E）。一致地，从TCGA LIHC队列中获得相同的结果（图1G）。在单因素分析中，HBsAg阳性状态，肿瘤分化差，肿瘤大小>5cm，存在MVI，AFP>400ng/μL，远处转移和高CEBPA-DT表达被确定为与HCC患者OS和RFS阴暗相关的潜在危险因素。这些变量进一步包含在多元回归模型中。结果显示，MVI和高CEBPA-DT表达是OS和RFS的独立危险因素。

图1 CEBPA-DT 在伴有肝外转移的肝细胞癌中上调，并与患者预后相关

2. CEBPA-DT促进肝癌细胞在体外和体内的增殖和转移

选取7个人肝癌细胞系，采用RT-qPCR检测CEBPA-DT的表达水平，结果表明，HCCLM9、SNU-449和SK-Hep1的CEBPA-DT表达水平高于Huh7、Hep3B和PLC/PRF/5。体外功能研究表明，沉默CEBPA-DT显著抑制HCCLM9和SNU-449细胞的细胞增殖（图2A，B）。同时，跨孔迁移、侵袭和伤口愈合迁移试验表明，肝癌细胞中CEBPA-DT下调后，细胞运动受到显著抑制（图2C-F）。此外，采用流式细胞术研究了细胞凋亡和细胞周期分布，结果表明，CEBPA-DT的耗竭显著提高了肝癌细胞的凋亡速率（图2G，H）。同时，在沉默CEBPA-DT后，观察到G0/G1期肝癌细胞百分比增加，S期肝癌细胞百分比降低（图2I，J）。接下来，通过Huh7，Hep3B和SK-Hep1细胞中的慢病毒感染构建过表达CEBPA-DT的稳定肝癌细胞系。CEBPA-DT的过表达显著提高了Hep3B和Huh7细胞的生长能力（图3A，B）。在过表达肝癌细胞的CEBPA-DT中观察到细胞运动的显著增强（图3C-F）。细胞凋亡试验表明，CEBPA-DT过表达降低了Huh7和Hep3B细胞的凋亡率（图3G，H）。细胞周期分析显示，CEBPA-DT过表达增加了S级分，降低了G0/G1级分（图3I，J）。

图2 CEBPA-DT的沉默在体外抑制肝癌细胞的肿瘤生长和转移

图3 CEBPA-DT在体外促进肝癌细胞的肿瘤生长和转移

研究者进一步确定了CEBPA-DT对体内致瘤性的影响。建立CEBPA-DT沉默HCCLM9细胞和CEBPA-DT过表达SK-Hep1细胞，并皮下注射到裸鼠体内。当CEBPA-DT被敲低时，观察到肿瘤体积和重量显著降低，当CEBPA-DT过表达时，获得相反的结果（图4A，B），表明CEBPA-DT促进体内肿瘤生长。为进一步评价CEBPA-DT对体内肿瘤转移的影响，建立了肝原位植入模型和肺转移模型。6周后，在肝脏中，CEBPA-DT沉默组观察到的GFP荧光强度低于对照组（图4C），当CEBPA-DT过表达时表现出相反的结果（图4D）。IVIS拍摄结果表明，CEBPA-DT敲低组与比对照组更弱的肺部生物发光信号强度相关（图4G）；同时，与空载体组相比，CEBPA-DT过表达增强了肺部的生物发光活性（图4H）。苏木精和伊红（HE）染色结果显示，CEBPA-DT沉默组的转移灶数量均在肝脏中减少（图4E）。相比之下，与对照组相比，CEBPA-DT过表达组的肝肺转移灶数量增加（图4F，J）。综上所述，CEBPA-DT是一种促癌lncRNA，可促进肝癌细胞在体外和体内的增殖和转移。

图4 CEBPA-DT促进体内肿瘤生长和转移

3. CEBPA-DT与RNA结合蛋白hnRNPC相互作用

为了验证CEBPA-DT是否充当“miRNA海绵”，研究者进行了生物信息学分析，以使用Starbase评估CEBPA-DT的潜在结合miRNA。结果表明，has-miR-532-3p是最具约束力的靶标。研究者接下来建立了CEBPA-DT野生型和突变荧光素酶质粒；通过野生型/突变的CEBPA-DT与NC模拟物/ miR-532-3p的共转染，通过Rluc/Fluc测量相对荧光素酶活性。为了验证CEBPA-DT是否通过与蛋白质结合来调节肿瘤生长和转移，研究者接下来进行了生物素标记的RNA pull-down和质谱（MS）以筛选与肝癌细胞中CEBPA-DT相互作用的蛋白质。由于RNA FISH和先前进行的亚细胞RNA分级分离测定证明CEBPA-DT主要位于细胞核中（图5A），仅使用核提取物进行RNA pull-down测定。银染在近40 kD处鉴定出特定的蛋白质条带，随后通过MS检测（图5B）。共鉴定出177种蛋白质作为CEBPA-DT相互作用靶标。其中，RNA结合蛋白异质核糖核蛋白C（hnRNPC）得分最高（图5B）。

为了验证CEBPA-DT与hnRNPC之间的相互作用，研究者确定了hnRNPC的亚细胞位置。接下来，生物素标记的RNA pull-down和RIP测定进一步证实了CEBPA-DT可以与hnRNPC相互作用（图5C，D）。为了进一步验证CEBPA-DT和hnRNPC之间的特异性相互作用位点，研究者构建了三个CEBPA-DT截短片段（1-750nt，751-1500nt和1501-2252nt）（图5E），以及基于RNA识别基序（RRM，16-87aa）的截短hnRNPC片段（图5G）。RNA pull-down测定显示，751-1500个核苷酸负责CEBPA-DT与hnRNPC的RNA识别基序之间的相互作用（图5F，H）。先前的一项研究证明，hnRNPC通过与c-myc相互作用，从细胞核部分地重新定位到细胞质。研究者假设CEBPA-DT和hnRNPC之间的相互作用可以激活hnRNPC的亚细胞重定位。亚细胞蛋白分离测定显示，CEBPA-DT的过表达上调了细胞质中hnRNPC的蛋白水平，同时降低了细胞核中的hnRNPC水平（图5I）。通过RNA FISH结合IF测定获得了类似的观察结果（图5J）。综上所述，这些数据表明CEBPA-DT可能在物理上结合hnRNPC并诱导hnRNPC从肝癌细胞的细胞核到细胞质的转定位。

图5 CEBPA-DT与RNA结合蛋白hnRNPC相互作用

4. CEBPA-DT通过hnRNPC-DDR2轴促进肝癌细胞的转移

更深入地了解CEBPA-DT在肝癌细胞中的致瘤作用。进行RNA测序以分析受CEBPA-DT沉默影响的转录组变化。聚类分析显示，CEBPA-DT沉默HCCLM9细胞中共有2040个下调基因。不同数据库中的进一步富集分析表明，细胞外基质相关途径和基因表现出最显著的改变（图6A）。这些分析的交集揭示了8个下调基因，这些基因受到RT-qPCR的影响，结果表明，沉默CEBPA-DT后，DDR2的mRNA水平下调最显著（图6B）。

作为普遍表达的异质核糖核蛋白（hnRNPs）家族的成员，hnRNPC作为RBP结合核RNA，对于许多mRNA的稳定和翻译至关重要，通常与靶mRNA的3' UTR区域相互作用。考虑到CEBPA-DT诱导hnRNPC从细胞核向细胞质的重新定位，以及CEBPA-DT调控DDR2 mRNA水平，研究者假设CEBPA-DT可能增强DDR2 mRNA的稳定性，从而通过增加hnRNPC的细胞质表达来促进翻译。为了验证这一猜想，研究者测量了用siRNA沉默hnRNPC后DDR2的mRNA和蛋白质水平。结果表明，DDR2 mRNA和蛋白质水平显著下调（图6C，D）。更关键的是，在CEBPA-DT上调后，hnRNPC与DDR2 mRNA之间的相互作用明显增强（图6E）。总之，这些结果表明DDR2是CEBPA-DT-hnRNPC复合物的下游靶标。

研究者相继研究了CEBPA-DT-hnRNPC轴对DDR2下调的影响机制。通过放线菌素D处理肝癌细胞，研究者发现CEBPA-DT的过表达降低了DDR2 mRNA的降解，延长了其半衰期，从而增加了DDR2 mRNA的表达，同时hnRNPC的缺失显著抑制了这种促进，提高了DDR2 mRNA水平（图6G）。一致地，在CEBPA-DT上调和hnRNPC沉默后，蛋白质水平表现出相同的变化趋势（图6F）。

先前的一项研究阐明DDR2有助于HCC侵袭和转移。研究者的体外功能研究表明，在沉默DDR2的mRNA和蛋白质水平后，肝癌细胞的运动性受到显著抑制。在功能上，伤口愈合和Transwell测定表明，CEBPA-DT的过表达可以增强肝癌细胞的运动性，而DDR2的缺失可以阻止这种增强。裸鼠肺转移模型也获得了类似的结果（图6H）。此外，通过在50个HCC样品中应用IHC和RT-qPCR，研究者发现与正常组织相比，HCC组织中DDR2的蛋白质和mRNA水平明显增加（图6I）。此外，DDR2的表达与HCC组织中CEBPA-DT的表达呈正相关（图6J）。综上所述，上述数据表明CEBPA-DT可以通过hnRNPC-DDR2轴促进HCC的转移。

图6 CEBPA-DT通过hnRNPC-DDR2轴促进肝癌细胞的转移

5. CEBPA-DT诱导肝癌细胞中的EMT

先前的研究表明，CEBPA-DT下调改变了EMT相关基因的表达；然而，CEBPA-DT参与EMT过程的分子机制尚不清楚。本研究首先采用RT-qPCR筛选了几种EMT标志物，包括上皮标志物E-钙粘蛋白（CDH1）、间充质标志物N-钙粘蛋白（CDH2）、Vimentin（VIM）、SNAIL1、SNAIL2、ZEB1、TWIST1和FOXC1，结果表明，敲低CEBPA-DT诱导上皮标志物CDH1的表达，同时抑制间充质标志物（CDH2、VIM、SNAIL1）的表达。同时，CEBPA-DT的过表达表现出相反的结果。在ZEB1，SNAIL2，TWIST1和FOXC1中没有观察到显著的变化（图7A）。为了检查EMT转录因子Snail1是否被CEBPA-DT激活，将Snail1启动子荧光素酶报告质粒转染到肝癌细胞中。结果表明，CEBPA-DT沉默显著降低了Snail1启动子的活性，而上调的CEBPA-DT显著诱导了启动子活性（图7B）。蛋白质印迹实验证实，CEBPA-DT过表达抑制了E-钙粘蛋白的蛋白表达，诱导了肝癌细胞中N-钙粘蛋白、Vimentin、Snail和DDR2的表达，而CEBPA-DT下调的结果相反（图7C）。根据蛋白质印迹测定，IF实验表明，CEBPA-DT的消耗显著增加了E-钙粘蛋白的表达，并降低了Vimentin和Snail的表达（图7D）。为了进一步验证EMT过程是通过CEBPA-DT激活Snail1诱导的，研究者在Huh7细胞中敲低了Snail1。CEBPA-DT上调促进间充质标志物的表达因沉默蜗牛1而减弱；在上皮标志物E-钙粘蛋白的表达中观察到相反的趋势（图7E）。综上所述，这些数据表明CEBPA-DT通过Snail1的转录激活诱导肝癌细胞中的EMT。

图7 CEBPA-DT在肝癌细胞中诱导EMT

6. CEBPA-DT通过DDR2和β-连环蛋白之间的相互作用促进EMT过程

作为Wnt/β-连环蛋白通路的核心成分，β-连环蛋白被发现在HCC转移中被定期激活，并与EMT过程密切相关。因此，研究者假设β-连环蛋白参与了CEBPA-DT调节的EMT过程。首先，亚细胞蛋白分级分离显示，细胞核组分中的β-连环蛋白表达在CEBPA-DT过表达肝癌细胞中显著上调，在CEBPA-DT沉默细胞中下调，而细胞质部分β-连环蛋白的表达保持不变（图8A）。接下来，免疫荧光测定表明，在CEBPA-DT沉默时，核β-连环蛋白显著重新定位到肝癌细胞的细胞质中。相反，CEBPA-DT上调后促进了β连环蛋白的核易位（图8B）。为了探索Wnt/β-连环蛋白信号传导的转录活性，进行了TOP/FOP-Flash荧光素酶报告测定，结果表明，在HCCLM9载体细胞和β连环蛋白过表达细胞中敲低CEBPA-DT降低了转录活性（图8E）。

为了评价β连环蛋白对蜗牛1启动子活性的调控能力，研究者进行了生物信息学分析，预测了β-连环蛋白在蜗牛1启动子区域的结合位点（图8C）。进一步的 ChIP-qPCR 测定表明 Snial1 启动子区域的结合位点 1 上β-连环蛋白显著富集；同时，CEBPA-DT沉默可以明显抑制这种富集（图8D）。

早期的一项研究已经证明了DDR2在EMT过程中的调节作用。研究者的数据证实DDR2受CEBPA-DT监管。因此，研究者推测DDR2和β-连环蛋白之间存在相互作用，这种相互作用是CEBPA-DT调控EMT过程所必需的。首先，使用针对DDR2的特异性抗体进行免疫共沉淀测定，结果表明DDR2确实可以与β-连环蛋白相互作用，并且在CEBPA-DT沉默后相互作用减弱，并在CEBPA-DT过表达后得到加强（图8F）。接下来，使用一种特异性抑制剂DDR2-IN-1来抑制DDR2。随着DDR2-IN-1的存在，由CEBPA-DT过表达调节的β-连环蛋白的核易位增加显著耗尽（图8G）。最后，蛋白质印迹试验显示DDR2抑制可能导致CEBPA-DT诱导EMT过程的抑制;β-连环蛋白的过表达挽救了这种抑制（图8H）。综上所述，CEBPA-DT通过DDR2与β-连环蛋白的相互作用促进了EMT过程。

图8 CEBPA-DT通过DDR2和β-catenin之间的相互作用促进EMT过程

结论：

综上所述，该研究将CEBPA-DT确定为HCC转移的效应物。此外，研究者发现CEBPA-DT通过与hnPNPC相互作用激活DDR2/β-连环蛋白轴来促进HCC的进展和转移。重要的是，该研究结果为lncRNA参与HCC转移的潜在分子机制提供了新的见解，并为进一步的CEBPA-DT靶向HCC治疗方法奠定了基础。

示意图：

说明CEBPA-DT在肝癌转移中的作用

参考文献：

Cai Y, Lyu T, Li H, Liu C, Xie K, Xu L, et al. LncRNA CEBPA-DT promotes liver cancer metastasis through DDR2/β-catenin activation via interacting with hnRNPC. J Exp Clin Cancer Res. 2022 Dec 6;41(1):335. doi: 10.1186/s13046-022-02544-6.