FSTL1通过调节PKM2的细胞内功能，使巨噬细胞功能重新编程，从而促进肝纤维化

卵泡抑素样蛋白1(FSTL1)是一种分泌糖蛋白，但其在肝纤维化巨噬细胞相关炎症调节中的作用尚未被证实。我们旨在描述巨噬细胞FSTL1在肝纤维化中的作用。构建髓系特异性FSTL1-敲除(FSTL1^M-KO)小鼠，探讨巨噬细胞FSTL1在注射四氯化碳、胆管结扎或缺甲硫氨酸和缺胆碱饮食诱导的3种小鼠肝纤维化模型中的功能和机制。FSTL1在人和小鼠纤维化肝脏巨噬细胞中的表达均显著升高。髓系特异性FSTL1缺失可有效减缓肝纤维化的进展。在FSTL1^M-KO小鼠中，在肝纤维化过程中形成的微环境表现出相对较少的炎症，这可通过单核/巨噬细胞和中性粒细胞浸润减弱以及促炎因子表达减少来证明。在体内和体外实验中，FSTL1^M-KO巨噬细胞表现出抑制的促炎M1极化和核因子κB通路激活。通过其FK结构域，FSTL1直接结合到丙酮酸激酶M2 (PKM2)。FSTL1促进PKM2磷酸化和核易位，减少PKM2泛素化以增强PKM2依赖的糖酵解，并增加M1极化。PKM2的药理激活(DASA-58)部分对抗FSTL1介导的糖酵解和炎症。巨噬细胞FSTL1通过诱导M1极化和炎症促进肝纤维化的进展，其机制是基于巨噬细胞胞内PKM2重编程功能。本文于2022年12月发表于Gut(IF=31.793)上。

技术路线：

主要研究结果：

(1) 纤维化肝组织巨噬细胞中FSTL1表达增加

为确定FSTL1在纤维化肝脏样本中的表达，我们收集了51份人类肝脏样本，包括正常和纤维化肝组织。与正常对照肝脏相比，纤维化肝脏中FSTL1的mRNA和蛋白表达明显升高(图1A,B)。接下来，我们确定FSTL1的表达是否主要在肝脏巨噬细胞中升高。双免疫荧光染色显示FSTL1主要表达于人纤维化肝脏的巨噬细胞上(图1C)。通过重新分析已发表的数据集，我们发现FSTL1表达在HCV诱导或NASH诱导的肝纤维化中显著升高(图1D)。

我们探索了FSTL1在三种被广泛认可的肝纤维化动物模型中的表达，即CCl₄注射诱导、BDL诱导和MCD饮食诱导的肝纤维化。所有模型的肝组织中FSTL1的表达均显著增加(图1E,F)。然后，我们从小鼠纤维化肝脏中分离肝脏巨噬细胞。从纤维化肝脏分离的巨噬细胞中，FSTL1 mRNA表达水平明显升高(图1G)。双免疫荧光染色进一步显示，纤维化肝脏中FSTL1⁺CD68⁺巨噬细胞明显多于对照肝脏(图1H)。在肝纤维化组织中，FSTL1在巨噬细胞上高表达，在HSCs上低表达，在肝细胞上不表达(补充图未展示)。综上所述，FSTL1在肝组织，尤其是纤维化肝脏巨噬细胞中的表达显著增加。

图1：肝纤维化组织巨噬细胞卵泡抑素样蛋白1 (FSTL1)表达增加

(2) 髓系FSTL1缺失可缓解肝纤维化

为了检测FSTL1⁺巨噬细胞在肝纤维化中的作用，我们使用Cre-LoxP系统构建了髓系特异性FSTL1-缺陷(FSTL1^M-KO)小鼠。然后，用CCl₄注射、BDL或MCD饮食诱导FSTL1^FL/FL和FSTL1^M-KO小鼠肝纤维化。图2A显示，与FSTL1^FL/FL小鼠相比，FSTL1^M-KO小鼠的肝纤维化明显较低，如Masson’s、Sirius Red和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)染色所示。此外，攻毒后FSTL1^M-KO小鼠血清丙氨酸转氨酶和天门冬氨酸转氨酶水平降低(图2B)。此外，FSTL^M-KO小鼠肝组织中TGF-β、TIMP-1和I型胶原蛋白的表达明显低于同窝对照组(图2C)。Western blot (WB)分析进一步显示，与对照组相比，FSTL1缺失降低了纤维化肝组织中I型胶原、α-SMA和TIMP-1的表达(图2D)。我们的研究结果表明，骨髓性FSTL1缺失可以减弱小鼠的肝纤维化。

图2：骨髓卵泡抑素样蛋白1 (FSTL1)缺乏可减轻小鼠肝纤维化

(3) 髓系FSTL1缺失可减弱纤维化肝脏中的炎症和巨噬细胞/中性粒细胞募集

我们研究了FSTL1⁺巨噬细胞对纤维化肝组织局部炎症的影响。图3A显示，FSTL1^M-KO小鼠的纤维化肝脏中肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-1β的表达低于对照组，IL-10的表达高于对照组。与同窝小鼠相比，FSTL1^M-KO小鼠的血清TNF-α和IL-1β水平始终较低，而IL-10水平较高(图3B)。我们通过在纤维化肝组织中染色F4/80和CD11b(巨噬细胞标记物)和Ly6G(中性粒细胞标记物)来评估肝脏炎症细胞的积累。与FSTL1^FL/FL小鼠相比，骨髓特异性FSTL1缺失显著减少了纤维化肝组织中巨噬细胞和中性粒细胞的浸润(图3C-E)。

图3：骨髓卵泡抑素样蛋白1 (FSTL1)缺乏可减轻小鼠纤维化肝脏的炎症

(4) 骨髓性FSTL1缺陷抑制纤维化肝脏中M1极化和NF-κB通路激活

髓系特异性FSTL1缺失可缓解肝脏炎症，这表明FSTL1可能促进M1极化。我们分析了肝脏切片中M1巨噬细胞的定量。与FSTL1^FL/FL小鼠相比，FSTL1^M-KO小鼠中iNOS⁺CD68⁺巨噬细胞更少(图4A)。在FSTL1^M-KO小鼠的纤维化肝脏中，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA表达下调，而Arg1表达上调(图4B)。WB分析显示，与对照组相比，骨髓性FSTL1缺陷小鼠纤维化肝脏中iNOS和p-STAT1表达降低，p-STAT6表达增加(图4C)。TLR-4/NF-κB通路是巨噬细胞介导的急性/慢性肝炎症的重要调控通路。对纤维化肝脏的免疫染色和WB分析也显示，FSTL1^M-KO小鼠TLR-4/NF-κB通路激活降低(图4D,E)。

图4：髓系卵泡抑素样蛋白1(FSTL1)缺乏抑制小鼠纤维化肝脏M1极化和核因子κB (NF-κB)通路激活

(5) FSTL1直接与PKM2结合，增强PKM2在巨噬细胞中的稳定性

为了进一步研究巨噬细胞FSTL1在肝纤维化过程中的调控机制，采用免疫沉淀(IP)和LC-MS/MS筛选方法探讨FSTL1与巨噬细胞中潜在蛋白的结合。我们要确定PKM2在巨噬细胞中是否直接与FSTL1相互作用(图5A,B)。FSTL1在巨噬细胞中与PKM2结合(图5C)。共聚焦免疫荧光分析显示，FSTL1与PKM2在细胞质和细胞核中共定位(图5D)。构建编码4个带有血凝素(HA)标记的FSTL1截断片段和3个带有FLAG标记的PKM2截断片段的质粒，转染293个T细胞(图5E)。FSTL1的FK结构域对于与PKM2的N-端或C-端相互作用至关重要(图5F)。这些结果表明，FSTL1通过FSTL1的FK结构域和PKM2的N-端或C-端直接与PKM2相互作用。环己亚胺chase实验的结果表明，在FSTL1下调的细胞中，PKM2的半衰期较短，而在FSTL1过表达的细胞中，PKM2的半衰期比对照细胞长得多(图5G)。这些结果表明FSTL1可能通过抑制蛋白酶体降解来调节PKM2的稳定性。通过向FSTL1^M-KO和FSTL1^o/e骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)培养中添加MG-132，PKM2蛋白水平的降低伴随FSTL1的下调得以恢复(图5H)。FSTL1的下调增加了FSTL1^M-KO BMDMs中PKM2蛋白的泛素化水平。泛素介导的PKM2降解作用在过表达FSTL1的BMDMs中被显著取消(图5I)。PKM2泛素化是PKM2磷酸化和核易位的关键步骤。

图5：卵泡抑素样蛋白1 (FSTL1)直接与丙酮酸激酶M2 (PKM2)结合，增强PKM2在巨噬细胞中的稳定性

(6) FSTL1促进PKM2磷酸化和纤维化肝组织巨噬细胞的核易位

为了探讨PKM2在FSTL1介导的巨噬细胞促炎表型转换中的作用，我们研究了PKM2在纤维化肝脏巨噬细胞中的表达是否发生改变。免疫荧光染色显示，与对照组相比，纤维化肝脏有更多的FSTL1⁺巨噬细胞(图6A，上面板)和PKM2⁺巨噬细胞(图6A，下面板)。PKM2和FSTL1在纤维化肝组织的细胞质和细胞核中的表达均明显增加(图6B)。免疫荧光染色显示，与对照组肝脏相比，患者肝脏巨噬细胞中PKM2和FSTL1的核易位明显增加(图6A，紫色区域)。相反，与FSTL1^FL/FL小鼠相比，髓系FSTL1的破坏明显减少了PKM2⁺巨噬细胞，并阻碍了PKM2在肝脏巨噬细胞中的核输入(图6C)。我们分析了分离的肝巨噬细胞细胞质中总PKM2和p-PKM2以及细胞核中总PKM2的蛋白表达情况。图6D显示，与FSTL1^FL/FL对照相比，FSTL1缺失降低了细胞质中总PKM2和p-PKM2的表达，进而降低了细胞核中总PKM2的表达。综上所述，巨噬细胞FSTL1促进PKM2的核转位。

图6：卵泡抑素样蛋白1(FSTL1)促进纤维化肝组织巨噬细胞的丙酮酸激酶M2 (PKM2)磷酸化和核易位

(7) FSTL1缺失减弱巨噬细胞的炎症反应、M1极化和糖酵解

为了进一步分析FSTL1在体外如何调节巨噬细胞功能，从FSTL1^FL/FL或FSTL1^M-KO小鼠细胞中分化出BMDMs，并对其进行脂多糖(LPS)刺激。FSTL1^M-KO巨噬细胞TNF-α和IL-1β表达降低，IL-10表达升高(图7A,B)。FSTL1缺失减弱了M1极化，并降低了LPS处理后BMDMs中的TLR-4/NF-κB通路激活(图7C-G)。FSTL1^M-KOBMDMs中PKM2表达及其核易位减弱(图7C,D)。为了探索FSTL1是否也调节糖酵解，我们检测了这些巨噬细胞的细胞外酸化率(ECAR)和相对乳酸释放水平。与FSTL1^FL/FL BMDMs相比，LPS刺激后FSTL1^M-KO BMDMs的ECAR和乳酸显著降低(图7H,I)。使用糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)阻断葡萄糖供应，FSTL1^M-KO BMDMs中IL-1β和iNOS表达的下降被抑制(图7J)。在LPS诱导的炎症环境中与BMDMs共培养HSCs。缺乏FSTL1的BMDMs显著降低α-SMA的表达，并减弱了造血干细胞的激活(补充图未展示)。

图7：卵泡抑素样蛋白1 (FSTL1)缺乏减弱巨噬细胞的炎症和糖酵解

(8) PKM2激活剂抑制巨噬细胞中FSTL1介导的M1极化和糖酵解

为了进一步确定PKM2对FSTL1诱导的巨噬细胞极化和糖酵解的影响，用小分子PKM2激活剂DASA-58。处理FSTL1过表达(FSTL1^o/e)的BMDMs, DASA-58减轻FSTL1^o/e诱导的TNF-α和IL-1β，同时增加IL-10水平(图8A,B)。PKM2、iNOS和p65的免疫荧光染色表明，抑制PKM2核转位逆转了FSTL1诱导的巨噬细胞M1极化和NF-κB激活(图8C,D)。这些结果通过BMDMs中PKM2、p-PKM2、iNOS、p-STAT1、p-STAT6、TLR-4、p-Ikk和p-p65表达的WB分析得到证实(图8E-G)。为了进一步验证PKM2在FSTL1介导的糖酵解中的作用，我们检测了ECAR和相对乳酸释放水平。与FSTL1^n/e BMDMs相比，FSTL1^o/e BMDMs中的ECAR和乳酸显著升高，DASA-58有效逆转了FSTL1^o/e诱导的糖酵解增加(图8H,I)。FSTL1^o/e相关的促炎介质(IL-1β和iNOS)被2-DG中和(图8J)。这些结果证实PKM2的核和细胞质功能对FSTL1诱导的M1极化、糖酵解和炎症至关重要。

图8：丙酮酸激酶M2 (PKM2)激活剂抑制巨噬细胞中卵泡抑素样蛋白1(FSTL1)介导的炎症和糖酵解

结论：

综上所述，我们揭示了巨噬细胞FSTL1在肝纤维化中的作用。FSTL1通过与PKM2结合，促进PKM2磷酸化和抑制PKM2泛素化在巨噬细胞中促进M1极化、糖酵解和炎症反应。通过识别FSTL1介导肝脏炎症的分子途径，我们的发现为改善巨噬细胞介导的肝脏炎症和纤维化的新治疗方法提供了基础。

参考文献：

Rao, J., Wang, H., Ni, M., Wang, Z., Wang, Z., Wei, S., Liu, M., Wang, P., Qiu, J., Zhang, L., Wu, C., Shen, H., Wang, X., Cheng, F., & Lu, L. (2022). FSTL1 promotes liver fibrosis by reprogramming macrophage function through modulating the intracellular function of PKM2. Gut, 71(12), 2539–2550. https://doi.org/10.1136/gutjnl-2021-325150.