类风湿关节炎中基于m6A甲基化调节因子的诊断基因标签和异常通路激活

类风湿性关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性疾病，其特征是滑膜组织肿瘤样增生，持续性滑膜炎症，骨侵蚀和进行性关节破坏。类风湿性关节炎通常发生在中年女性中。目前，RA的发展归因于遗传和环境因素，如吸烟，肥胖，压力，神经抑郁和女性荷尔蒙。RA患者发生恶性肿瘤的风险高于一般人群。最近，RA患者的临床症状和并发症的管理越来越受到医务工作者的关注。深入了解RA发生和发展的机制有助于及早发现RA及其并发症，以便采取措施控制疾病的发展并减少疾病的活动。该研究发表于《Frontiers in Immunology》，IF：8.786。

技术路线：

研究示意图：

图1 研究示意图

主要研究结果：

1. 使用m6A调节器的RA分类方法的性能

考虑到m6A甲基化调节剂在肿瘤和免疫疾病进展中的重要作用，作者使用公共数据集全面探讨了19种m6A甲基化调节剂对RA诊断的重要性。基于这19种m6A甲基化调节因子的表达水平，使用五种不同的机器学习方法构建了疾病诊断模型（RA与非RA）：使用Boruta，Rpart，LASSO，XGBoost和逻辑回归的随机森林优化。除Rpart模型外，所有模型的精度和AUC均大于0.8。为了比较每种机器学习方法的性能，作者观察了每个模型作为验证集中分类器的性能。验证集中每种机器学习方法的性能也是可变的（图2A-F）。在验证数据集1中，逻辑回归模型和LASSO_λ-min 模型的 AUC 最高（0.90），但 LASSO_λ-min 模型的准确度更高（0.901）。Rpart模型的AUC最低（0.8）。在验证数据集2中，LASSO_λ-min 模型和 LASSO_λ-1se 模型的准确度最高（0.89）和 AUC（0.88）。在这些模型中，Rpart模型的性能最差。此外，每种机器学习方法选择的m6A甲基化调节剂数量不同，Boruta选择最多（14个调节剂），Rpart模型仅选择一个调节剂。考虑到每种机器学习方法在验证集中的性能及其在模型中选择的调节器数量，LASSO_λ-1se模型不仅在验证集中表现更好，而且在变量筛选方面也表现出更严格的要求。这些结果表明，LASSO_λ-1se模型具有良好的临床应用价值和实用性。因此，作者进一步比较了LASSO_λ-1se模型在全血样品中的性能，并计算出AUC值为0.83（图2G），进一步提示LASSO_λ-1SE模型在基于血液的RA诊断中具有临床应用前景。

图2 验证集1和验证集2的ROC曲线，模型在单独的集上训练

2. RA分类中更重要的m6A甲基化调节剂

通过这些多变量机器学习方法选择不同的候选生物标志物。然而，生物标志物通常具有相同的准确性和重要性。考虑到Rpart模型的性能最差，作者专注于不同机器学习方法选择的重叠m6A甲基化调节因子，包括使用Boruta，LASSO，XGBoost和逻辑回归（图3A）。每种型号都选择了两种重叠的m6A甲基化调节剂：IGF2BP3和YTHDC2。在训练数据集中进一步比较了19 m6A甲基化调节剂的表达水平。IGF2BP3和YTHDC2在RA和非RA患者中的表达水平差异有统计学意义（图3B）。更重要的是，基于转录水平，IGF2BP3和YTHDC2在训练集中的RA诊断中也表现良好（图3C），AUC值分别为0.85和0.75。此外，当Boruta（图3D）、Rpart（图3E）和XGBoost（图3F）算法计算了19 m6A甲基化调节剂的重要性，IGF2BP3和YTHDC2排名较高；IGF2BP3 具有最高的重要性。

图3 在RA分类中比较重要的m6A甲基化调节剂

3. IGF2BP3在RA-FLS的活力和细胞周期中的重要性

根据途径富集分析结果，IGF2BP3和YTHDC2与细胞周期密切相关。但是，当Boruta（图3D）、Rpart（图3E）和XGBoost（图3F）算法计算了19 m6A甲基化调节因子的重要性，IGF2BP3排名第一，YTHDC2排名较低。此外，与YTHDC2相比，IGF2BP3对RA的诊断效能更好（图3C）。因此，作者通过分子生物学实验进一步探讨了IGF2BP3对RA-FLSs活力和细胞周期的调控作用。为了探索IGF2BP3对RA-FLS的影响，将siRNA转染到RA-FLS中。RT-qPCR和蛋白质印迹法证实了转染结果，表明siRNA具有良好的敲低效率（图4B-D）。然后，作者研究了IGF2BP3对体外RA-FLS活力的影响。CCK-8细胞毒性测定显示，与对照细胞相比，RA-FLS中IGF2BP3的下调显著降低了细胞活力（P<0.05，图4E）。细胞增殖测定还显示，与对照细胞相比，RA-FLS中IGF2BP3的下调显著抑制了细胞增殖（P<0.05，图4F）。此外，流式细胞术结果显示，IGF2BP3的低表达对G2/M通道有明显影响。与对照组相比，siIGF2BP3组G2/M期细胞比例显著增加（P<0.05，图4G，H）。作者还测量了细胞周期相关蛋白的表达，表明siIGF2BP3降低了CCNB1和C-MYC的表达（图4C，D）。此外，检测OA（osteoarthritis）和RA患者滑膜组织中IGF2BP3的表达。作者发现RA患者滑膜组织中IGF2BP3表达显著较高，进一步证实了 IGF2BP3 在 RA 进展中的重要性（图4I）

图4 IGF2BP3在RA-FLS的活力和细胞周期中的重要性

4. IGF2BP3表达与炎症活性的相关性

为了鉴定RA中IGF2BP3相关的免疫特征，作者用xCell确定了免疫评分和免疫细胞的比例。首先，作者发现两组之间的免疫评分差异有统计学意义，RA患者组的免疫评分高于NC患者组（P<0.001；图5A）。然后，比较两组免疫细胞的比例。许多免疫细胞的比例存在显著差异，包括指间细胞（IDC）、自然杀伤T（NKT）细胞、经典树突状细胞（cDC）、巨噬细胞、肥大细胞、M2巨噬细胞、Th2细胞、M1巨噬细胞和肌细胞（图5B，C）。在这些细胞类型中，作者专注于M1巨噬细胞，因为M1巨噬细胞与RA之间存在密切关系。RA患者M1巨噬细胞比例显著高于对照患者。此外，作者研究了类风湿性关节炎患者M1巨噬细胞比例与IGF2BP3表达水平的关系，发现它们具有很强的相关性（图5D）。IGF2BP3表达也与M1巨噬细胞标志物的表达显著相关，包括IL1A、CD86和TLR2（图5E-G）。因此，作者认为IGF2BP3可以参与M1巨噬细胞极化的调节。

为了进一步探索IGF2BP3对M1巨噬细胞极化的影响，作者用Igf2bp3-siRNA或NC-siRNA（阴性对照）转染了RAW264.7细胞。通过RT−qPCR和蛋白质印迹分析确认了基因沉默的效率，表明siRNA具有良好的敲低效率（图5H，I）。转染后48小时，用100ng/ml LPS处理RAW264.7细胞24小时。然后，通过流式细胞术测定M1巨噬细胞表面标志物（CD86）的表达，作者发现CD86在siIgf2bp3细胞中的表达水平明显低于siNC细胞（图5J）。此外，作者进一步检测了细胞上清液中TNF-a的含量，这表明siIgf2bp3细胞中TNF-a的含量低于siNC细胞（图5K）。这些结果进一步验证了IGF2BP3参与M1巨噬细胞极化的调节。

图5 IGF2BP3表达与炎症活性之间的相关性

5. scRNA-seq揭示了IGF2BP3表达与M1巨噬细胞极化的关系

为了进一步确定IGF2BP3表达和M1型巨噬细胞极化之间的关系，我们在GSE159117数据集中进行了scRNA-seq。通过统一流形近似和投影（UMAP）分析得到14个细胞簇（图6A）。SingleR（版本1.8.1）用于鉴定7种细胞类型：B细胞，CD4 T细胞，CD8 T细胞，树突状细胞，单核细胞，NK细胞和T细胞（图6B）。发现IGF2BP3主要在七种细胞类型（图6C）。巨噬细胞是来源于单核细胞的主要细胞类型。因此，探讨CD86与IGF2BP3在单核细胞中的表达关系，发现CD86和IGF2BP3具有共表达趋势（图6D）。然后，作者初步研究了几种巨噬细胞标志物在单核细胞中的表达。M1巨噬细胞标志物（包括CD86，IL1B，TLR2和TLR4）在单核细胞中显著上调，但M2巨噬细胞标志物（包括MSR1，IL10，MMP14和VEGFA）下调（图6E）。

图6 UMAP图显示了收集的scRNA-seq细胞样品的来源

结论：

该研究首次证实了m6A阅读器蛋白IGF2BP3对RA进展的影响，并通过生物信息学分析和分子生物学实验验证了其生物学功能。该研究为RA的早期诊断和靶向治疗提供了新的思路和策略，具有理论创新前景。此外，它还为发现RA的新标志物和药物靶点提供了理论支持。

参考文献：

Geng Q, Cao X, Fan D, Gu X, Zhang Q, Zhang M, Wang Z, Deng T, Xiao C. Diagnostic gene signatures and aberrant pathway activation based on m6A methylation regulators in rheumatoid arthritis. Front Immunol. 2022 Dec 13;13:1041284. doi: 10.3389/fimmu.2022.1041284. PMID: 36582238; PMCID: PMC9793088.