10分以上的单细胞测序文章！揭露早期糖尿病性肾病的机械损伤信号通路

糖尿病肾病（Diabetic nephropathy，DN）是导致终末期级肾脏疾病的主要原因，而组织病理学肾小球病变是DN最早的结构改变之一。然而，启动这些肾小球改变的信号通路尚不完全清楚。为阐明DN发生的细胞和分子基础，作者对DN早期的2型糖尿病小鼠肾脏细胞进行单细胞和整体RNA测序。差异表达基因分析显示，肾小球细胞类型中葡萄糖‑独立应答。肾小球细胞程序上游的基因调控网络提示机械敏感性转录通路MRTF‑SRF的激活主要发生在系膜细胞。重要的是，在独立的患者队列数据中，在DN肾小球中也发现MRTF‑SRF转录通路的激活。此外，体外肾灌注提示MRTF - SRF的调节是肾小球过滤的常见机制。总的来说，本研究展示早期DN的单个细胞转录组图谱，突出机械敏感信号通路作为糖尿病肾病的新靶点。本研究于2023年1月10日发表于期刊《Genome Med》，IF：10.18。

技术路线：

主要研究结果：

1、早期DN的BTBR ob/ob小鼠肾脏的scRNA-seq

作者生成了BTBR.Cg-Lep^{ob/ob WiscJ}；Gt (ROSA)26Sor^{tm4(ACTB−tdTomato,−EGFP)Luo}；Tg(NPHS2-cre)^295Lbh；小鼠足状突细胞报告（简称BTBR ob/ob或DN小鼠），以研究DN中发生的细胞和分子变化。基于研究前期的预实验观察，本研究将6周龄定义为DN发病期，12周龄定义为DN早期。

从总共16只小鼠中取样肾组织，包括6周龄和12周龄的BTBR ob/ob（DN）和BTBR WT（对照）小鼠中的雄性和雌性小鼠。使用Percoll梯度部分去除样品的近端小管（PT）段，以富集肾小球。使用冷活化蛋白酶（CAP）制备单细胞悬液，以减少肾细胞中解离诱导的假象。共70944个细胞进行预处理和质量控制（图1B）。每种细胞类型的定义标记基因和每个簇的五篇标记基因在点图（图1C）。

2、DN肾脏细胞类型特异性改变提示糖尿病的葡萄糖依赖性和葡萄糖非依赖性反应

接下来，作者比较DN与对照肾脏中细胞类型中基因表达水平。总体上，作者发现6周时，所有类型的细胞中有447个差异表达基因（DEGs）；12周时，所有类型的细胞中有740个DEGs（图1D）。表明主要是这两种类型细胞在DN的早期阶段受到影响。富集分析在6周和12周时在肾小球细胞类型和PT细胞类型中识别出显著的通路（图1E-F）。肾小球细胞类型表现出对细胞外基质分子、细胞粘附、细胞增殖等的调节作用，以及对机械应力、细胞因子和血压的细胞应答。PT细胞类型表现出多种代谢过程，例如生物氧化，以及参与氧化应激的反应，例如NRF2和PPAR信号通路。这些差异表明早期DN中PT和肾小球细胞类型分别具有葡萄糖依赖性和葡萄糖非依赖性反应。

图1 早期DN的BTBR ob/ob小鼠肾脏的scRNA-seq

3、人类和实验性DN的共同特征

将来自scRNA-seq的细胞基因表达数据与大量RNA-seq数据进行比较。足细胞、EC_1/gECs和系膜细胞显示正Pearson相关系数，表明两个数据集之间存在线性相关性（图2A）。将单细胞和大量RNA-seq数据集的肾小球DEGs取交集，得到194个独特基因（图2B），这些基因被映射到欧洲肾脏cDNA库（ERCB）患者数据集。在显微解剖的DN患者肾小球中，106个基因的mRNA表达受到显著调节（图2B-C）。重要的是，在单细胞和大量RNA-seq数据中，在人DN肾小球中检测到的大多数DEGs在系膜细胞中均发生显著变化（图2C）。

图2人类和实验性DN的共同特征

4、DN肾小球中机械敏性转录调控因子被激活

为识别DN肾小球细胞类型中导致基因差异表达的转录调控，作者使用独创性途径分析（IPA）进行上游分析，该分析不仅识别转录因子，还识别转录辅调控因子，如辅激活因子。在单细胞和体RNA-seq数据中通常改变的转录调控因子如图3A所示。有趣的是，作者观察到机械敏感转录调节因子的激活，包括心肌相关转录因子A和B（MRTFA/B）和yes相关蛋白1（YAP1或YAP），以及转录因子血清反应因子（SRF）。SRF活性在系膜细胞中较高，在足细胞和gECs中等或较低（图3B）。

在DN肾小球细胞类型中具有显著调控作用的MRTF-SRF转录靶基因如图3C所示。MRTFA和在足细胞和gEC的细胞质和细胞核中发现MRTFB，在对照组和DN小鼠中表现出相当的表达水平（图3D）。对照组小鼠系膜细胞中MRTFA表达水平较低，而DN小鼠中部分系膜细胞中MRTFA核积累（图3D）。重要的是，MRTFB在系膜细胞中的核积累是明显的，特别是在系膜扩张发生的区域（图3D）。

图3 DN肾小球中机械敏性转录调控因子被激活

5、MRTF转录靶基因在DN合并2型糖尿病患者中表达上调

微解剖肾小球mRNA表达分析显示，小鼠DN中显著改变的各种基因在早期人类DN中也被显著调控（图4A）。其中许多靶基因与系膜体积呈正相关（图4B）。MRTF转录靶基因被定位于ERCB数据集。这些基因在肾病和其他可能引起机械应激的疾病以及肾小球硬化的各种其他肾小球疾病的肾小球中被显著调控，但在微小变化疾病（MCD）中没有（图4C）。

接下来，作者通过免疫荧光染色研究早期人DN的MRTFA和MRTFB的表达和位置。在健康和早期DN肾活检样本中，所有三种肾小球细胞类型中检测到MRTFA的基础和相当的表达水平（图5）。与小鼠实验结果一致，DN、MRTFB在健康人大部分系膜细胞中不存在，但在肾小球病变处的系膜细胞核中积累（图5）。总之，作者对人和小鼠DN的免疫荧光染色分析证实MRTFB在DN早期系膜细胞中的激活。

图4 MRTF转录靶基因在DN合并2型糖尿病患者中表达上调

图5 免疫荧光验证早期DN系膜细胞中MRTFB的激活

6、肾小球系膜细胞表现出主要的信号网络

作者的结果表明，MRTF-SRF转录调控在小鼠和人DN中都被激活，主要是在系膜细胞中。此外，作者还鉴定多种系膜细胞标记基因，这些基因编码跨膜蛋白，负责机械信号的感知和转导，包括机械敏感离子通道（MSCs）、GPCRs、整合素和钙粘蛋白（图6A）。接着，作者比较DN与对照组小鼠中所有肾细胞类型之间的相互作用强度，结果显示DN肾脏中系膜细胞与所有其他细胞类型的相互作用主要（图6B）。此外，系膜细胞主导细胞间通信（图6C），并在DN肾小球中作为发送者与gEC和足细胞广泛相互作用（图6D）。这些相互作用涉及各种众所周知的与慢性肾脏疾病（CKD）发病机制相关的生长因子信号通路，如骨形态发生蛋白（BMP），成纤维细胞生长因子（FGF），血管内皮生长因子（VEGF），以及多种细胞外基质蛋白和整合素之间的相互作用。

图6 肾小球系膜细胞表现出主要的信号网络

7、体外肾灌注激活机械敏感信号通路

作者分别生成了离体小鼠肾小球（图7A）和猪肾皮质组织的整体和单核转录组学数据。并比较灌注和未灌注情况下的基因表达。在体外灌注的小鼠肾小球中，上游的DEGs分析显示MRTFA/B、SRF和YAP1被激活（图7B）。对显著改变的MRTF转录靶基因进行富集分析，发现了肌动蛋白细胞骨架组织、VEGFA-VEGFR2信号通路、平滑肌收缩、PDGFRB通路以及细胞对外部刺激的反应（图7C）。在体外灌注的猪肾中，从灌注和未灌注的肾皮质组织中共鉴定出11692个单核（图7D）。基于之前报道的单核细胞数据的细胞/核他异性标记基因，Unsupervised clustering识别出18个簇，将其分为12种细胞类型（图7E）。作者鉴定主要的肾小球细胞类型，包括由核标记基因MEIS1和FHL2定义的基质细胞类型（图中“STROMA”表示）（图7F）。猪肾皮质免疫荧光染色显示，MEIS1阳性细胞主要由系膜细胞组成，也有部分间质细胞（图7G）。对DEGs的上游分析显示，基质细胞中MRTFA/B、SRF和YAP1被激活，足细胞和内皮细胞中YAP1和MRTFB被激活（图7H）。显著调控的MRTF转录靶基因主要存在于基质细胞中（图7I）。这些发现支持作者的假设，即机械敏感信号通路的激活是肾小球过渗反应的常见机制。

图7肾体外灌注激活机械敏感信号通路

结论：

作者的研究展示早期DN的全面单细胞转录组景观，并揭示随着DN的发生和发展而发生的基因表达的细胞特异性改变。作者对肾小球细胞类型的深入分析表明，机械敏感信号与糖尿病性肾小球病变相关，并可能在肾小球过渗反应中发挥驱动作用。在肾小球硬化的背景下，MRTF转录途径可能是肾小球共同机制的一部分。

参考文献：

Liu S, Zhao Y, Lu S, Zhang T, Lindenmeyer MT, Nair V, Gies SE, Wu G, Nelson RG, Czogalla J, Aypek H, Zielinski S, Liao Z, Schaper M, Fermin D, Cohen CD, Delic D, Krebs CF, Grahammer F, Wiech T, Kretzler M, Meyer-Schwesinger C, Bonn S, Huber TB. (2023). Single-cell transcriptomics reveals a mechanosensitive injury signaling pathway in early diabetic nephropathy. Genome Med;15(1):2. doi: 10.1186/s13073-022-01145-4.