硅藻硅化细胞壁的胞吐作用涉及广泛的膜解体

硅藻是单细胞藻类，其细胞壁为硅质。这些二氧化硅元素在膜结合的二氧化硅沉积囊泡中在细胞内形成，并在完成后被胞吐。硅藻在这些大而硬的二氧化硅介质的胞吐过程中如何维持膜稳态仍然未知。本文利用活细胞共聚焦显微镜、透射电镜和冷冻电子断层扫描技术，研究了两种硅藻模型物种的细胞壁形成和胞吐。结果表明，在其形成过程中，矿物相与二氧化硅沉积囊泡膜紧密结合，形成了精细几何图案的精确模具。在胞吐过程中，远端二氧化硅沉积囊泡膜和质膜逐渐与矿物分离，并在细胞外空间分解，没有任何明显的内吞回收或细胞外再利用。在细胞内，近端二氧化硅沉积囊泡膜成为细胞与其环境之间的新屏障，并承担了新的质膜的作用。这些结果提供了硅藻二氧化硅胞吐的直接结构观察，并指出了一种非凡的机制，其中膜稳态是通过丢弃而不是回收，重要的膜补丁来维持的。本文于2023年1月发表于Nature Communications (IF=17.694)。

技术路线：

主要研究结果：

(1) S. turris和T. pseudonana的形态学研究

我们通过研究两种硅藻S. turris和T. pseudonana，研究了硅藻的瓣膜胞吐(图1)。S. turris的瓣膜呈囊状，有两层结构。近端层很薄，被纳米级孔穿孔，远端层被更高的层覆盖，形成大的多边形(图1a’,a”)。多边形层的顶部被压平，在截面上形成“T”形(图1a”’)。S. turris细胞形成链，通过从瓣膜顶端延伸的管状连接二氧化硅延伸连接(图1a，箭头)。T. pseudonana细胞呈桶状，体积小得多，阀瓣为直径约5 μm(图1b)。在径向肋之间的硅层上有小孔，而较大的管状孔装饰着阀门的边缘(图1b’,b”)。图1e,f显示了在瓣膜形成期间和之后不久细胞的分裂。新形成的阀门用PDMPO染色，PDMPO是一种荧光染料，在生物矿化过程中掺入二氧化硅。将细胞大小与成熟瓣膜在胞吐前的大小进行比较，说明了这些坚硬的二氧化硅细胞壁胞吐所涉及的巨大挑战(图1g,h)。

图1：S. turris和T.pseudonana的细胞结构

(2) S. turris膜和二氧化硅动力学的活细胞成像

我们使用活细胞的延时共聚焦显微镜研究了S. turris的膜动力学(图2)。在硅化过程中，PDMPO和FM4-64信号几乎共定位到共聚焦显微镜的分辨率(图2a)。这表明质膜和SDV内不断增长的二氧化硅结构之间非常接近，即质膜衬SDV形状。然而，连接延伸部分的生长尖端仅用膜染料染色，这表明SDV伸长先于其最边缘部分的硅化(图2a，箭头)。

我们记录了S. turris细胞在瓣膜形成和胞吐的整个过程中的膜动态延时(图2b)。通过荧光质膜可见瓣膜形成的过程，勾勒出不断增长的多边形二氧化硅层和连接延伸部分(图2b, t=0到t=126)。胞外作用的开始，即质膜-SDV-二氧化硅复合物的松动是明显的，因为标记的质膜不再清晰地勾勒出多边形(图2b, t=132)。

连接扩展段周围的FM4-64信号在其生长过程中是连续的，但在扩展段达到完全大小后，荧光信号变为间断的斑块，逐渐消失(图2b, t=156和t=234)。在某些情况下，围绕连接延伸的膜明显不再连接到细胞体(图2b’)。FM4-64只标记结构完整的膜，当膜被分解时，它将不再标记畸形的碎片。这些观察指向了一种情况，远端膜的主要部分完全脱离主细胞表面，逐渐解体，并在最近分裂的子细胞之间的细胞外空间失去荧光标记。

图2：S. turris中的阀形成期间三维重建的时移共聚焦荧光图像显示协调二氧化硅和膜动力学

(3) S. turris中二氧化硅形成和胞吐的超微结构

为了在超微结构分辨率下观察相同的过程，我们准备了分裂的S. turris细胞进行透射电镜分析。S. turris细胞的透射电镜图像显示，细胞环境的保存非常好，特别是SDV的膜和无机内容物(补充图未展示)。

我们从227个细胞在细胞周期的不同阶段获得了数百张图像，分类和排序后重建了S. turris中瓣膜形成和胞外分泌的时间轴(图3)。具有含有生长瓣膜的SDV的细胞被归类为处于瓣膜形成阶段(n=61，图3a-b”)。远端SDV膜与质膜非常接近，距离仅为10-30nm(图3a”，插图)。在早期瓣膜形成期间，SDV仅延伸至硅沉积的深度(图3a”)。多孔基层形成后，在其远端形成多边形层(图3b-b”，箭头)。当瓣膜仍然完全封闭在SDV中时，观察到23个细胞，一个完整的SDV包含一个完全成熟的瓣膜(图3c-c”)。

在68个细胞的图像中，一个成熟的瓣膜被一些不连续的SDV膜包围，即SDV没有形成一个完整的外壳。我们定义这些细胞正在进行胞吐。这些膜的不连续可能是非常局部的，而大部分瓣膜仍然被SDV紧紧包围(图3d-d”)。远端SDV和瓣膜周围的质膜的紧密描绘松动，观察到远端膜的结构完整性恶化(图3e-e”)。瓣膜近端膜现在与父瓣膜下的质膜连续(图3e”，箭头)。在胞吐过程结束时，由于其位于亲本束带下，可以识别出新的瓣膜，而在细胞质外看不到膜的可见痕迹(n=75，图3f-f”)。

我们分析了新形成瓣膜附近的膜的显微镜数据，以确定可能与SDV膜回收有关的内吞膜回收的迹象。观察到7例胞吐期细胞膜内陷的情况。这些内陷的大小从0.5-3 μm不等(补充图未展示)。然而，这种内陷在瓣膜形成和胞吐的所有阶段都有检测，发生率相似(Χ²_{(df=2, N=152)}=2.23, p=0.327)，因此与胞吐后膜循环无关。总的来说，在瓣膜胞吐过程中，远端膜在细胞外解体，没有恢复的迹象，而新瓣膜近端唯一可见的膜是SDV膜近端。

图3：透射电镜图像显示了S. turris的瓣膜形成和胞吐的顺序阶段

(4) T. pseudonana中二氧化硅胞吐的原生态纳米级结构

为了使细胞组织尽可能接近原生状态，我们获得了T. pseudonana细胞进行瓣膜胞吐的冷冻电子断层扫描(cryo-ET)数据。使用骤降冷冻和聚焦离子束制备薄薄片，在低温条件下收集电子层析图，玻璃化同步T. pseudonana细胞。在59对成像的子细胞中，15对发生在瓣膜胞吐期间或后不久，即第一组束带胞吐之前。其中4例发生在胞吐早期，新瓣膜仅部分被SDV膜覆盖(图4a-d)。

图4a,c显示了同对子细胞不同位置的断层图。左侧的瓣膜仍然完全封闭在SDV内，而右侧的瓣膜已经通过远端膜覆盖的不连续暴露在细胞外空间。在胞吐前的子细胞中，可以看到膜的预期排列：质膜覆盖整个细胞，并紧密地覆盖在SDV膜下面，完全包围瓣膜(图4a,b，左侧)。然而，在胞吐过程中，远端膜在多个部位融合，形成扁平膜囊网络，使瓣膜近端膜成为细胞的最外层边界(图4a,b，右侧)。在瓣膜周围也观察到类似的情况，在翼状口远端可见不相连的膜性结构(图4c,d，右侧)。

在8对处于胞吐后期的细胞中，位于两个子细胞最近胞吐的瓣膜和它们的束带之间的大膜性囊泡(图4e)。在剩下的三对最近有胞外瓣膜的细胞中，两个子细胞之间没有囊泡或膜残留物。然而，在这三个细胞中，亲代束带并没有包围子细胞，这表明细胞周期的后期，所有细胞外碎片都被降解了。没有一个成像的细胞含有发芽的内吞囊泡或在瓣膜下形成新膜的迹象。低温ET数据表明T. pseudonana使用与我们从S. turris收集的数据推断的相同的胞吐机制，其中近端SDV膜被重新利用为新的质膜，远端膜在细胞外分解(图4f)。

图4：细胞内冷冻ET显示T. pseudonana瓣膜胞吐的原生状态解剖

结论：

本文提出了硅藻二氧化硅胞吐的独特机制。首先，细胞器膜被重新利用成为质膜，其次，膜的大规模分解。这一机制被两种模式硅藻物种所共享，可能是一种普遍机制。随着硅藻遗传研究工具箱的增长，很快就有可能研究参与这一事件的调节的蛋白质机制，以及它与经典胞吐的关系。

参考文献：

deHaan, D., Aram, L., Peled-Zehavi, H., Addadi, Y., Ben-Joseph, O., Rotkopf, R., Elad, N., Rechav, K., & Gal, A. (2023). Exocytosis of the silicified cell wall of diatoms involves extensive membrane disintegration. Nature communications, 14(1), 480. https://doi.org/10.1038/s41467-023-36112-z.