LINC01018/miR-942-5p/KNG1轴调控胶质瘤的体内外恶性发展

神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，死亡率高，约占全球所有原发性脑肿瘤的60%。由于其快速增殖的能力，恶性胶质瘤浸润周围正常组织的可能性很高。尽管胶质瘤的手术联合放化疗等治疗方式取得了相当大的进展，但治疗结果仍然不令人满意。到目前为止，胶质瘤发病的分子机制仍然在很大程度上未知，因此很难开发出有效的胶质瘤治疗方法。因此，有必要弄清楚胶质瘤进展的潜在机制，并制定可行的胶质瘤治疗方法。该研究发表于《CNS Neuroscience & Therapeutics》，IF：7.035。

研究路线：

主要研究结果：

1. KNG1在脑胶质瘤中低表达，与miR-942-5p在脑胶质瘤中高表达呈负相关

采用生物信息学分析分析胶质瘤的基因表达变化，确定胶质瘤生成的关键基因。根据TargetScan，starBase，miRDB和miRWalk的预测，MiR-942-5p和miR-455-5p可能是可以靶向KNG1的miRNA（图1A）。同时，还预测miR-942-5p和miR-455-5p高表达水平的LGG患者生存率较差（图1B，C）。此外，利用cBioPortal分析miR-942-5p和miR-455-5p与预后的相关性。结果显示，浅缺失组和二倍体组miR-942-5p的肿瘤组织学分级和初始治疗后的新发肿瘤事件与深度缺失组相比得到促进（图1D，E）。然后评估神经胶质瘤患者癌症病变和邻近正常样本中KNG1，miR-942-5p和miR-455-5p的水平（图1F-I）。如图1F、G所示，通过生物信息学分析预测了神经胶质瘤中KNG1的低水平（图1G），并在临床组织中进行了验证（图1F）。此外，miR-942-5p在胶质瘤组织中高表达（p<0.001，图1H），而癌组织和正常组织之间的miR-455-5p水平没有差异（p>0.05，图1I）。此外，研究者发现KNG1和miR-942-5p在正常组织（r=-0.403，p=0.003）和癌组织（r=-0.447，p<0.001）中的表达呈负相关（图1J，K），而miR-455-5p和KNG1之间不存在相关性（图1L，M）。相应地，与NHA细胞相比，神经胶质瘤细胞中KNG1的转录和翻译水平显著降低（p<0.001，图1N，O），而胶质瘤细胞中的miR-942-5p水平信号增强（p<0.05，图1P）。鉴于KNG1在LN-229细胞中的表达最低，在T98G细胞中的表达最高，故选择这两种细胞进行后续实验。

图1KNG1在胶质瘤中表达低，与miR-942-5p呈负相关，后者在胶质瘤中高表达

2.沉默KNG1促进LN-229和T98G细胞的迁移、侵袭和增殖，而过表达KNG1则相反

在T98G和LN-229细胞中沉默或过表达KNG1以确定其在胶质瘤中的功能。通过RT-qPCR和蛋白质印迹分析检测转染效率。将siKNG1转染到LN-229和T98G细胞后，与转染siNC的细胞相比，KNG1的转录和翻译水平明显抑制（p<0.01，图2A-D），而转染KNG1过表达质粒后观察到相反的趋势（超过两倍水平）（p<0.001，图 2E-H）。之后，研究者检测到KNG1对LN-229和T98G细胞迁移和侵袭能力的影响（图3A-H）。结果表明，转染siKNG1后LN-229和T98G细胞的迁移率（图3A，B）和侵袭率（图3E，F）均显著增加（p<0.05），转染KNG1过表达质粒后均降低（p<0.01，图3C，D，G，H）。随后，进一步确定相关基因的水平以验证上述发现（4A-H）。如图4A、B、E、F所示，在转染siKNG1的LN-229和T98G细胞中，SNAIL1，TWIST1，Vimentin，ZEB1和N-钙粘蛋白的表达上调，E-钙粘蛋白的表达明显下调（p<0.05）。相比之下，图4C、D、G、H显示KNG1过表达对上述基因在两个细胞中的表达产生了相反的影响。如图4I-L所示，转染siKNG1导致两个细胞的集落形成率明显增加（p<0.001），而转染KNG1过表达质粒导致菌落形成率明显降低（p<0.01）。所有这些结果表明，敲低KNG1增强了LN-229和T98G细胞的恶性生物学活性，而过表达KNG1则相反。

图2 siKNG1和KNG1过表达质粒在LN-229和T98G细胞中的转染效率

图3 沉默KNG1增强LN-229和T98G细胞的迁移和侵袭，而过表达KNG1则相反

图4沉默KNG1通过调节相关基因促进LN-229和T98G细胞的增殖，而过表达KNG1则相反

3. MiR-942-5p靶向KNG1并调控KNG1的表达

在验证KNG1对T98G和LN-229胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用后，检测到miRNA靶向KNG1。Targetsscan预测KNG1可能是miR-942-5p的目标，因为KNG1-3'-UTR包含miR-942-5p的目标碱基序列（图5A）。然后研究者进行了双荧光素酶报告基因测定以验证这一预测（图5B，C）。结果表明，与模拟对照+KNG1-3'-UTR组相比，模拟物+ KNG1-3'-UTR组的荧光素酶活性受到明显抑制，而模拟物+ KNG1-3'-UTR突变组的荧光素酶活性没有变化（p<0.001）。研究者还确定了转染后miR-942-5p表达的变化（图5D，E），发现miR-942-5p水平在转染miR-942-5p抑制剂后明显下调，但在转染miR-942-5p模拟物后明显上调约两倍（p<0.001）。然而，siKNG1和miR-942-5p抑制剂共转染或KNG1和miR-942-5p模拟物共转染后，miR-942-5p水平没有明显变化，表明KNG1不能影响miR-942-5p的表达。如图5F、G所示，miR-942-5p抑制剂显著上调KNG1的蛋白质和mRNA水平（p<0.001）。然而，与siNC相比，siKNG1逆转了miR-942-5p抑制剂的促进作用（p<0.001）。此外，在图5H、I中可以注意到，miR-942-5p模拟物显著降低了KNG1的蛋白质和mRNA水平（p<0.001），过表达KNG1（p<0.001）逆转了KNG1。所有这些发现表明miR-942-5p靶向KNG1并调控KNG1的表达。

图5 MiR-942-5p靶向KNG1并调控KNG1的表达

4.过表达KNG1和敲低KNG1分别抵消了miR-942-5p模拟物和抑制剂对LN-229和T98G细胞迁移、侵袭和增殖的调控作用

通过检测迁移、侵袭和增殖速率的变化来衡量KNG1联合miR-942-5p对胶质瘤细胞的影响。如图6A、C、E所示，miR-942-5p抑制剂（p<0.05）显著降低了LN-229细胞的迁移，侵袭和集落形成速率，siKNG1（p<0.05）显著逆转了其趋势。同时，如图6B、D、F所示，miR-942-5p模拟物显著提高了T98G细胞的迁移、侵袭和集落形成速率（p<0.01），KNG1（p<0.001）明显逆转了其趋势。所有这些发现都表明miR-942-5p通过靶向KNG1来调节胶质瘤细胞的恶性生物活性。

图6 KNG1逆转了miR-942-5p模拟物对LN-229和T98G细胞迁移、侵袭和增殖的促进作用，siKNG1抵消了miR-942-5p抑制剂对双细胞迁移和侵袭的抑制作用

5.在胶质瘤中低表达的LINC01018特异性靶向miR-942-5p

验证了靶向miR-942-5p/KNG1轴并在胶质瘤中起作用的lncRNA。通过分析Ago CLIP-seq数据支持的miRNA-lncRNA相互作用，获得9个候选lncRNA。其中，MALAT1、LINC01018和MEG3在胶质瘤中的表达较低（图7B-D），发现这三种是可能靶向miR-942-5p的lncRNA（图7A）。RNA pull-down测定结果证实，miR-942-5p可以在LN-229和T98G细胞中与LINC01018和MEG3结合（图7E，F）。考虑到miR-942-5p与LINC01018的结合比与MEG3的结合强，因此挑选出LINC01018用于以后的应用。之后，starBase v2.0的数据预测miR-942-5p和LINC01018之间存在结合位点（图7G）。为了验证这一预测，进行了双荧光素酶报告基因测定（图7H，I）。结果表明，与miR NC + LINC01018组和miR-942-5p + LINC01018组相比，miR-942-5p + LINC01018组的荧光素酶活性降低（p<0.001），而miR-942-5p + LINC01018 mut组的荧光素酶活性与miR NC + LINC01018 mut组相比没有变化，这意味着LINC01018可以与miR-942-5p结合。此外，研究者还使用RIP进一步验证LINC01018是否可以靶向miR-942-5p（图7J，K）。结果表明，相对于输入组和抗Ago2组，抗IgG组析出LINC01018和miR-942-5p（p<0.001），证明miR-942-5p可被LINC01018直接靶向。

图7 LINC01018在胶质瘤中低表达，特异性靶向miR-942-5p

6.过表达和敲低LINC01018分别逆转了miR-942-5p模拟物和抑制剂对LN-229和T98G细胞迁移和侵袭的调控作用

检测LINC01018/miR-942-5p/KNG1轴对细胞迁移和侵袭的影响和分子机制。如图8A、C所示，LN-229细胞的迁移和侵袭率因过表达LINC01018而明显降低，但通过miR-942-5p模拟物显著增强（p<0.05）。图8B、D显示，miR-942-5p抑制剂显著抑制了T98G细胞的两种速率，但LINC01018的shRNA显著促进（p<0.01）。此外，过表达LINC01018和miR-942-5p抑制剂下调了SNAIL1、Vimentin和ZO1等侵袭相关因子的蛋白和基因表达，但LINC01018和miR-942-5p模拟物的shRNA上调（p<0.05）；然而，E-钙粘蛋白的蛋白质和基因水平显示出相反的变化趋势（图9A-D）。上述结果证实了LINC01018通过靶向miR-942-5p来调节胶质瘤细胞的迁移和侵袭。

图8 过表达和敲低LINC01018分别逆转了miR-942-5p模拟物和抑制剂对LN-229和T98G细胞迁移和侵袭的调控作用

图9 LINC01018过表达和敲低分别降低了miR-942-5p模拟物和抑制剂对LN-229和T98G细胞细胞周期分布和相关基因表达的影响

7.过表达和敲低LINC01018分别抵消了miR-942-5p模拟物和抑制剂对LN-229和T98G细胞细胞周期分布和增殖的调控作用

测试了LINC01018/miR-942-5p/KNG1轴对细胞周期和增殖的影响和分子机制。如图9E所示，过表达LINC01018明显增加了G1期LN229细胞的比例（p<0.001），而S期（p<0.05）和G2期（p<0.001）的过表达明显降低了LN229细胞的比例。相比之下，miR-942-5p模拟物显著降低了G1期（p<0.01）和G2期（p<0.05）LN229细胞的比例，显著提高了S期（p<0.05）的LN229细胞比例。这些结果表明，miR-942-5p模拟物正向改变了LN-229细胞的细胞周期分布，而过表达LINC01018产生了相反的效果，可以进一步逆转miR-942-5p模拟物对细胞周期分布的阳性作用。如图9F所示，LINC01018和miR-942-5p抑制剂的shRNA分别具有与过表达LINC01018和miR-942-5p模拟物相反的作用，LINC01018的shRNA中和了miR-942-5p抑制剂对细胞周期分布的影响。在细胞增殖方面（图10A，B），LN-229细胞的相对集落形成受到LINC01018过表达的显著阻碍，并通过miR-942-5p模拟物（p<0.01）促进，而T98G细胞的相对集落形成受到LINC01018的shRNA的强烈促进，并被miR-942-5p抑制剂阻断（p<0.05）。此外，miR-942-5p模拟物和抑制剂对细胞增殖的影响分别被过表达和敲低LINC01018抵消。然后，研究者检测到增殖相关蛋白的表达（图10C，D）。过表达LINC01018显著降低了CDC25A和细胞周期蛋白D1的表达（p<0.05），明显升高了CDKN2A的表达（p<0.01），而miR-942-5p模拟物产生了反向效应，可以通过过表达LINC01018逆转。LINC01018和miR-942-5p抑制剂的shRNA对这些蛋白的影响分别与过表达LINC01018和miR-942-5p模拟物相反，LINC01018的shRNA可以逆转miR-942-5p抑制剂对细胞增殖的影响。所有这些发现都反映了LINC01018通过靶向miR-942-5p来调节胶质瘤细胞的增殖。

图10 过表达和敲低LINC01018分别逆转了miR-942-5p模拟物和抑制剂对LN-229和T98G细胞增殖的影响

8. LINC01018靶向miR-942-5p调控肿瘤生长、KNG1表达和MVD

通过动物实验验证LINC01018靶向miR-942-5p对体内胶质瘤的影响。与肿瘤图片和肿瘤重量统计图一致（图11A，B），注射LN-229细胞的小鼠肿瘤重量因过表达LINC01018而降低，但通过miR-942-5p模拟物升高，而注射T98G细胞的小鼠肿瘤重量因miR-942-5p抑制剂降低，但通过敲低LINC01018增加（p<0.001）。此外，在注射LN-229细胞的小鼠中，过表达LINC01018进一步逆转了miR-942-5p模拟物的作用，并且在注射T98G细胞的小鼠中，miR-942-5p抑制剂的作用被敲低LINC01018抵消（p<0.001）。根据图11C、D，LINC01018的表达在LN-229细胞中被过表达LINC01018显著上调，但在T98G细胞中被shRNA LINC01018下调（p<0.001）。在LN-229细胞中，miR-942-5p（图11E，F）的表达因过表达LINC01018而明显降低，但被miR-942-5p模拟物明显升高。在T98G细胞中，miR-942-5p的表达被miR-942-5p抑制剂显著抑制，但被敲低LINC01018明显促进（p<0.01）。此外，在LN-220细胞中，过表达LINC01018显著逆转了miR-942-5p模拟物的作用，而t98G细胞中的敲低LINC01018抵消了miR-942-5p抑制剂的作用。研究者还检测了KNG1的蛋白质和基因表达（图12A，B），结果表明KNG1表达在LN-229细胞中被过表达LINC01018明确上调，但被miR-942-5p模拟物明显下调，而KNG1表达由miR-942-5p抑制剂促进，但在T98G细胞中被LINC01018敲低抑制（p<0.01）。此外，LINC01018在LN-229细胞中的过表达显著逆转了miR-942-5p模拟物对KNG1表达的影响，而敲低LINC01018在T98G细胞中逆转了miR-942-5p抑制剂对KNG1表达的影响。免疫组织化学数据也进一步验证了这些结果（图12C，D）。由于KNG1可以抑制血管生成，因此采用免疫组织化学检测MVD。如图13A、B所示，研究者发现过表达LINC01018抑制MVD，而敲低LINC01018则相反。此外，miR-942-5p模拟物和抑制剂分别显著中和了过表达和敲低LINC01018对MVD的影响（p<0.05）。

图11 LINC01018靶向miR-942-5p调节体内肿瘤生长

图12 LINC01018靶向miR-942-5p调节KNG1在体内的表达

图13 LINC01018靶向miR-942-5p调控微血管密度

结论：

该研究结果证实，过表达LINC01018可通过靶向miR-942-5p/KNG1轴抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭以及裸鼠胶质瘤的生长。该研究丰富了胶质瘤的发生机制，为后续研究奠定了基础。

参考文献：

Xu J, Wang J, Zhao M, Li C, Hong S, Zhang J. LncRNA LINC01018/miR-942-5p/KNG1 axis regulates the malignant development of glioma in vitro and in vivo. CNS Neurosci Ther. 2023 Feb;29(2):691-711. doi: 10.1111/cns.14053.