顺铂诱导可变剪接的机制初探
pre-mRNA的选择性剪接（AS）是真核生物基因表达中的一个关键分子事件。AS控制转录组的定性多样性，并扩展蛋白质组的功能库。此外，癌症治疗中使用的基因毒剂会引起癌细胞转录组的重编程。这些变化反映了细胞对压力的反应，是导致一些耐药性机制的基础。本研究分析了顺铂在乳腺癌细胞中诱导的pre-mRNA剪接的全基因组变化。本研究于2022年12月发表在《NUCLEIC ACIDS RESEARCH》IF：19.160期刊上。
技术路线：
主要实验结果：
1、顺铂处理影响mRNA水平和pre-mRNA间接
为描述癌细胞中与DNA损伤相关的转录组变化，用顺铂（50 μM，24h）处理MCF-7乳腺癌细胞，并与未处理的对照组进行RNA-seq对比分析。选择MCF-7细胞是因为它们被认为对这种基因毒性药物具有相对抗性。差异分析显示，顺铂处理后共有2310个RNA存在差异表达（DE），其中绝大多数为mRNA，且整体上看顺铂对转录本的下调略多于上调（图1A）。针对“Hallmarks MSigDB集合”对DEmRNA进行GSEA，发现NF-κB和p53通路具有最高的阳性富集评分，MYC靶标和G2/M相关基因是最高的阴性富集评分（图1B）。GO分析显示，DEmRNA在多个与DNA损伤应答（DDR）激活兼容的生物过程中富集，包括“信号转导”、“凋亡过程的正向调控”、“细胞对DNA损伤刺激的反应”或“DNA损伤反应，p53类介质的信号转导导致细胞周期阻滞”（图1C）。
AS分析发现，在顺铂处理的细胞转录组中，共有2922个AS事件影响1873个mRNA（图1D）。其中，选择性剪接外显子（a-SE，也称为盒式外显子）是目前为止最常见的，占总变化的69.9%，影响1433个mRNA。顺铂诱导的a-SE的mRNA在与DNA修复和复制、链间交联修复、细胞-细胞粘附和mRNA加工包括剪接等相关的生物过程中显著富集（图1E）。值得注意的是，在受顺铂影响的基因中，只有10.7%（197/1832）含有顺铂依赖的a-SE（图1F）。此外，与a-SE相关的差异剪接基因（DSG）相关的GO与DEG相关的GO不同，这表明顺铂的转录和转录后（例如剪接）效应针对不同的基因组（图1C与图1E比较）。
图1顺铂诱导MCF-7细胞中大量转录组改变
2、顺铂诱导缺乏E4和5的COASY短异构体的表达
在试图将顺铂对AS的影响与耐药机制联系起来时，作者将注意力转向了与线粒体功能相关的基因。有趣的是，作者发现9.2%（132/ 1433）的转录本经过顺铂介导的a-SE编码了MitoCarta 3.0（人类线粒体蛋白质和途径数据库）中列出的蛋白质；相比之下，只有4.5%的DEG（84/1832）编码MitoCarta数据库中存在的蛋白质，这表明顺铂可能优先通过AS影响线粒体相关转录本。在132个与线粒体功能相关的AS转录本中，作者重点研究COASY，它编码辅酶A合成酶。RNA-seq分析显示，在顺铂处理后，COASY经历了一个复杂的AS事件，包括两个连续的a-SE（外显子4和5，E4-5）的跳跃，但是它的表达在mRNA水平和蛋白均未改变（图2A）。COASY转录本中E4-5的跳跃会生成一个较短的COASY亚型，与全长亚型同框，但缺乏独特的ATP结合位点，因此缺乏催化活性。作者利用位于上游外显子3和下游外显子6的外显子的引物，采用异构体识别终点RT-PCR验证了COASY E4-5的跳跃（图2A）。该方法可以同时扩增缺乏和含有E4-5的COASY mRNA异构体，以下分别称为COASY-short和COASY-FL，并计算剪接比（SOR，即short/FL）。结果发现MCF-7细胞主要表达FL亚型，如SOR值<1，顺铂处理导致短变异比例以剂量和时间依赖的方式增加（图2B，C）。此外，其他DNA损伤药剂也可诱导COASY E4-5的跳跃，只是程度不同（图2D）。同样，COASY E4-5剪接模式改变的强度与DNA损伤剂对细胞活力的影响相关。喜树碱和阿霉素对COASY E4-5的影响最强，对MCF-7细胞的毒性也最高（图2E）。相反，依托泊苷和H2O2对MCF-7活性的影响较小，对E4-5包合物水平无影响（图2E）。这些观察结果表明，长异构体和短异构体之间的剪接开关可能与对DNA损伤剂的敏感性有关。为验证这一点，作者比较了COASY E4-5在同源的顺铂敏感和耐药的卵巢癌（分别为A2780 A和A2780 DDP）、回盲腺癌（分别为HCT8 A和HCT8 DDP）的细胞株中的剪切模式。在两种细胞类型中，敏感细胞对顺铂的反应中，COASY E4-5的跳跃增加，导致更多的COASY-short亚型（图2F-G）。相比之下，在耐药细胞中COASY E4-5剪接不受顺铂影响。总之，这些观察结果表明COASY短亚型的表达与顺铂诱导的细胞死亡相关。
图2由顺铂或其它DNA损伤药物诱导的COASY-短亚型缺失E4和E5
3、缺乏E4-5的COASY-short亚型下调改变线粒体的形状、功能和顺铂敏感性
为确定COASY-short亚型是否在顺铂敏感性中起作用，通过异位表达或敲除实验调节其水平。免疫荧光成像显示，异位表达的COASY-FL或-short亚型主要定位于线粒体（图3A）。该实验也揭示了过表达的COASY-short显著改变了线粒体网络，表现为拉长的相互连接的线性结构。对具有“管状”或“碎片状”表型的细胞进行定性视觉检查和计数，这是一种常规用于评估线粒体形态的方法，证实了短亚型的表达使裂变/融合平衡倾斜，有利于融合和“管状”形态（图3B）。基于这些观察，接下来通过功能丧失实验评估COASY-short亚型在顺铂诱导的线粒体动力学和功能变化中的作用。为此，设计了两个针对E3-E6连接的siRNA，从而特异性靶向短亚型，而对全长转录本或蛋白没有影响。通过冷冻电子显微镜观察线粒体超微结构，发现COASY-short敲除的细胞的嵴密度降低和线粒体肿胀（图3C）。和文献报道一致，顺铂促进线粒体融合，并显著影响对照MCF-7细胞的线粒体网络，表现为管状线粒体的细胞百分比从没有顺铂时的20%上升到顺铂暴露后的80%以上（图3D，E）。值得注意的是，在COASY-short表达抑制的细胞中，顺铂对线粒体裂变/融合动力学的影响被废除，表现为这些细胞中的大多数在顺铂处理后保留了碎片化的线粒体网络。总之，这些实验表明，顺铂诱导的线粒体变化最有可能是由于COASY-short的表达，而不是由于COASY-FL。
由于COASY-short亚型促进线粒体融合，接下来通过测量氧化磷酸化来评估因COASY-short敲除的细胞的线粒体功能。与对照组比较，在COASY-short亚型敲除的情况下，无论是未处理的还是顺铂处理的细胞，耗氧率（OCR），包括与ATP生成相关的OCR都降低了（图3F，G）。此外，在没有顺铂的情况下，COASY-short亚型的缺失对MCF-7的健康和活力没有影响，但显著降低顺铂的细胞毒性作用，并增加了细胞耐药性（图3H，I）。这些结果表明，COASY短亚型的缺失会降低线粒体融合和活性，并且顺铂诱导会改变AS事件，例如产生COASY-short亚型，从而作用于其毒性。
图3 MCF-7细胞中COASY-短亚型诱导线粒体融合和凋亡
4、RBM39的失活介导了顺铂对AS的很大一部分作用
接下来，以COASY E4-5的跳跃为典型事件揭示顺铂调控AS的分子机制。在顺铂诱导的1832个DE mRNA中，只有9个（3个上调，6个下调）被注释到“mRNA通过剪接体剪接”（图1）。这使得顺铂不太可能通过调节剪接调控因子的表达间接影响AS，虽然这仍然是一种可能性。为鉴定顺铂驱动AS的潜在效应因子，使用先前验证的siRNA敲除了56个潜在的剪接调控因子，并通过RT-PCR在未处理的MCF-7中监测COASY的E4-5的包含情况。COASY E4-5包合的差异统计为敲除细胞和对照细胞的拼接百分比的差异（图4A）。为最大限度地提高识别相关剪接因素的机会，只考虑导致剪接变化超过20%的敲除，其中，SF3A1、RBM39和SF3B4的影响最为明显（图4A）。SF3A1和SF3B4都是与U2 snRNP相关的剪接因子，耗尽这些一般的剪接因子预计会非特异性地影响许多替代外显子的剪接。RBM39是一个著名的RNA结合蛋白，已被证明可以调节几个基因的替代剪接。因此，作者将注意力集中在RBM39上，并测试其可能参与顺铂依赖性调节特定AS的假设。首先，使用两种不同的siRNA验证了RBM39的缺失促进了E4-5的缺失，与顺铂类似（图4B）。为测试这种影响是否仅限于COASY，用siRBM39#2敲除RBM39，并通过RNA-seq分析在全基因组范围内分析了相关的剪接变化。结果显示RBM39下调对AS影响较大，共导致7131起AS事件，其中最多的是a-SE（图4C）。通过比较RBM39依赖的和顺铂诱导的SE，在468个独立基因上鉴定出577个事件，占所有顺铂诱导SE的28.2%（577/2045），这表明近三分之一顺铂诱导的a-SE也由RBM39控制（图4D）。引人注目的是，这577个事件中的88%（24.8%E4-5排除率降低，63.6% E4-5排除率增加）受到RBM39基因敲除或顺铂治疗的类似影响，而只有12%受到相反的调节（图4E）。通过RT-PCR分析一系列SEs，验证了RBM39缺失和顺铂处理对类似阳性和阴性定性转录调控的例子（图4F）。与顺铂类似，敲除RBM39可诱导MCF-7细胞凋亡，但下调RBM39并没有进一步提高顺铂的死亡率（图4G）。这些结果说明顺铂诱导AS事件很大一部分依赖于RBM39。
图4大部分顺铂依赖SE修饰都受RBM39调控
5、顺铂促进了c-Jun和RBM39之间的联系，并通过减少RBM39与COASY pre-mRNA的结合来控制COASYE4-5的排斥
由于RBM39的缺失和顺铂处理对COASY E4-5的包含有类似的影响，所以作者假设顺铂可能导致RBM39失活。由于作者发现顺铂不能影响RBM39的mRNA和蛋白表达，也不能影响其亚细胞定位。所以，作者在研究顺铂与RBM39之间的联系时，将注意力转向了二聚体AP-1 TF的主要成分c-Jun，因为RBM39与可c-Jun特异性结合，并作为AP-1的转录共激活剂。重要的是，文献报道c-Jun可被顺铂激活，通过其反式活化结构域（TAD）的磷酸化和转录上调，并参与了几种癌症的顺铂耐药机制。所以，作者假设c-Jun可能会干扰RBM39依赖的剪接。首先，通过共免疫沉淀实验，在未处理和顺铂处理的MCF-7细胞中监测c-Jun与RBM39的相互作用，结果发现在没有顺铂的情况下，c-Jun和RBM39之间没有免疫共沉淀，而顺铂处理导致了两种蛋白质之间的强大关联（图5A）。为验证顺铂诱导的RBM39和c-Jun之间的关联不仅仅是c-Jun水平增加的结果，使用基于gagasia荧光素酶酶活性接近互补的替代蛋白-蛋白相互作用试验验证了该结果（图5B）。
作为一种TF，c-Jun的N端TAD结构域在S63/S73和T91/T93残基被c-Jun N端激酶（JNK）磷酸化激活，这被认为促进了其与共激活剂的相互作用。与此报道一致，使用针对S63、S73和T91的磷酸化特异性抗体的免疫印迹分析显示，顺铂诱导MCF-7细胞中这些残基的c-Jun持续磷酸化（图5C）。然而，添加JNK抑制剂JNK-IN-8减少了顺铂诱导的c-Jun磷酸化，但不影响其与RBM39的相互作用响应顺铂的能力（图5D）。
作者使用一种特殊方法捕获直接与RBP结合的RNA，结果与之前的RIP实验一致，观察到内源性RBM39向COASY pre-mRNA的募集，而在表达c-Jun的细胞中，顺铂存在时募集减少（图5E），而在c-Jun KD细胞中未检测到RBM39与COASY结合的减少（图5F）。为证实这一模型，评估了c-Jun耗尽对COASY E4-5剪接的影响。在无顺铂的情况下敲除c-Jun对E4-5包含无影响（图5G，H）。然而，下调c-Jun显著降低了对顺铂应答的短变异体比例，确立了c-Jun在顺铂介导的COASY AS中的重要性。与这些结果一致， c-Jun的缺失对细胞死亡中的细胞存活没有影响，但显著降低了MCF-7对顺铂的敏感性（图5I）。总之，顺铂诱导的c-Jun相互作用干扰RBM39剪接活性并促进E4-5从COASY mRNA跳跃。
图5顺铂促进了c-Jun和RBM39之间的联系，并通过减少RBM39与COASY pre-mRNA的结合来控制COASYE4-5的跳跃
6、c-Jun参与全基因组顺铂诱导的AS，独立于其转录活性
为将发现扩展到COASY之外，通过对c-Jun缺失的MCF-7细胞进行RNA-seq分析，并将其对顺铂的转录组反应与对照细胞的转录组反应进行比较，评估c-Jun在全基因组顺铂介导的AS中的重要性。发现c-Jun缺失显著减弱MCF-7对顺铂的转录组反应。在稳态mRNA水平上，尽管在siCtl和sic-jun处理的细胞中被顺铂差异调控的基因组在很大程度上重叠，但c-Jun敲除使顺铂调控的mRNA总数减少了约38%（图6A）。当检测sic-jun处理的细胞中仍受顺铂影响的960个转录本时，观察到对于其中的80%的转录本，在没有c-Jun的情况下，顺铂的影响都略显逊色（图6B）。敲除c-Jun对顺铂诱导的AS有更强的作用（图6C）。c-Jun在顺铂诱导的剪接反应中的重要性在特异性观察RBM39依赖与RBM39不依赖的a-SE时更为明显（图6D）。因为在没有c-Jun的情况下，顺铂的作用更低，这些a-SE定义了一组剪接变化，这些剪接变化依赖于c-Jun介导的顺铂处理时RBM39的失活。通过RT-PCR验证了c-Jun KD对具有代表性的RBM39依赖的a-SE的抑制作用（图6E）。
作者使用了几种方法来评估顺铂/c-Jun/RBM39轴调控的a-SE是否优先影响c-Jun靶基因转录的mRNA。首先，将相应的基因（n = 468）与分子特征数据库（MSigDB）中的C3转录因子靶基因集进行比较，发现AP-1相关基因集没有明显的重叠。然后，建立自己的306个实验验证的AP-1依赖基因集，定义为两个列表TREDD和TRRUST之间的相互作用。在这些高置信度的AP-1靶点和468个交替拼接的基因之间只有7个基因有共同之处，这并不代表明显的重叠（图6F）。作者还对照已发表的顺铂处理后BT474乳腺癌细胞中c-Jun结合的209个不同启动子清单，发现没有明显重叠（图6G）。最后，对公开的MCF-7中c-Jun的ChIP-seq数据集的分析显示，在不同剪接基因的TSS周围或a-SE周围250bp的c-Jun峰没有明显富集，如COASY所示（图6H）。总之，这些结果表明，c-Jun参与顺铂依赖性剪接，独立于其转录功能和它在DNA上的存在。
图6 c-Jun参与顺铂对基因表达和选择性剪接的影响
综上所述，本研究证实顺铂处理促进了c-Jun和RBM39之间的相互作用，阻止了RBM39与COASYpre-mRNA内含子4的结合，导致COASY-short亚型的产生和表达，COASY-short亚型促进线粒体融合和细胞凋亡。
图7 c-Jun对顺铂作用下COASY pre-mRNA剪接的调控模型
参考文献：
Lemaitre Florence., Chakrama Fatima., O'Grady Tina., Peulen Olivier., Rademaker Gilles., Deward Adeline., Chabot Benoit., Piette Jacques., Colige Alain., Lambert Charles., Dequiedt Franck., Habraken Yvette.(2022). The transcription factor c-Jun inhibits RBM39 to reprogram pre-mRNA splicing during genotoxic stress. Nucleic Acids Res, undefined(undefined), undefined. doi:10.1093/nar/gkac1130