单一的单细胞测序仍能抢占7分
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种常见的呼吸系统疾病，其发病复杂性与衰老/吸烟密切相关，但人们对其了解甚少。本研究利用单细胞测序技术阐明COPD的发病机制，并证明了靶向单核细胞在COPD诊断和治疗中的潜力。本研究于2022年12月发表在《Respiratory Research》IF：7.162期刊上。
技术路线：
主要实验结果：
1、在不同条件下细胞类型特异性基因表达改变
作者对3例COPD患者，3例年龄匹配的老年对照，3例年轻的对照的肺组织样本进行scRNA-seq检测，其中4例主动吸烟者（AS）和5例从不吸烟者（NS）。然后按照图1所示的流程和方法建立一个新的综合COPD病理模型，并阐明衰老和吸烟是如何促进COPD发展的。
图1 scRNA分析流程图。
质量控制之后，共计注释到15种类型的细胞，包括14种已知细胞类型，包括巨噬细胞，树突状细胞，单核细胞，肥大细胞，中性粒细胞，自然杀伤细胞，T细胞，B细胞，肺泡1型细胞（AT1），AT2，俱乐部细胞，纤毛细胞，基质细胞和内皮细胞，以及一种被称为增殖细胞的细胞增殖标记高度阳性的独特未知聚类，在最近发表的人类肺组织scRNA-seq数据集中也被检测到（图2A）。为了以细胞类型特异性的方式独立评估与COPD、衰老和吸烟相关的分子改变，采用线性混合模型来识别每种条件下的差异表达基因（DEGs）。衰老相关的DEGs富含衰老的分子特征，反映了老年受试者的衰老肺部的一般状况；与吸烟相关的生物过程是最不同的，但它们仍然强调吸烟诱导的细胞应激和脂质代谢和囊泡运输的变化（图2C）。为了进一步揭示与COPD相关的基因，作者发现免疫细胞中与COPD相关的DEGs主要来自单核细胞，包括NF-κB信号基因，如REL、IL1B、KLF4和FLNA；在非免疫细胞中，最高的DEGs来自AT2s和俱乐部细胞，包括AZGP1、SNRPG、HNRNPM、EIF3E、TIE1和IL7R（图2C）。将GWAS数据与COPD相关基因整合在一起，以确定影响COPD遗传性的细胞类型，并证明GWAS COPD风险基因在单核细胞中的DEGs中大部分过高，其次是at2和内皮细胞（图2D）。为了确定COPD、衰老和吸烟下的优先细胞类型，对数据进行了下采样，以比较所有细胞类型中相同数量的细胞，发现COPD中单核细胞的DEG数量最多，而衰老和吸烟下的俱乐部细胞和巨噬细胞分别是受影响最大的类型（图2E）。这一发现得到了AUGUR的验证（图2F）。两项分析都显示，在所有条件下，单核细胞都是最优先的细胞类型；因此，是接下来分析的重点。
图2在不同条件下细胞类型特异性基因表达改变
2、单核细胞的条件特定状态显示了系统级异常的快照
鉴于单核吞噬细胞系统（MPS）中细胞类型的共享功能和转录组相似性，我们首先通过将我们的数据与最近发表的2个肺scRNA-seq数据集进行比较，排除了聚类错误的可能性。接下来，进行GSEA分析，结果发现在COPD中，主要由NF-κB和TNF信号介导的炎症反应在单核细胞中异常激活（图3A），以及一些下游过程，如细胞凋亡和白细胞迁移的负调控（图3B），这清楚地表明单核细胞是先天免疫的组成部分。值得注意的是，参与IFN-γ产生的基因，包括典型的IFN-γ刺激因子IL18，在衰老单核细胞中显著上调（图3C, D），这表明IL-18介导的信号通路负责炎症的维持。最近的研究表明，端粒功能障碍可通过YAP1复合物诱导IL-18介导的信号通路激活。本研究表明，衰老单核细胞中下调的DEGs在DNA损伤反应和端粒维持方面得到丰富（图3C）， YAP1复合物的成分，以及对炎症小体激活和YAP1稳定至关重要的2种去泛素酶都显著激活，即USP7和USP47（图3D）。与慢性阻塞性肺病和衰老单核细胞形成鲜明对比的是，活跃吸烟者肺中的单核细胞主要功能为抗原呈递细胞(APCs)，与活跃吸烟者相比，参与MHC II类抗原呈递的基因在上调的DEGs中过高（图3E）。本研究和其他研究一致将CD14+中间单核细胞定义为单核细胞群体中的APCs，作者观察到活跃吸烟者中中间亚型的比例大幅增加（图3F）。为了排除细胞组成的偏差仅仅是随机抽样的结果的可能性，进行了轨迹分析，以确定负责单核细胞从经典亚型分化到中间亚型的潜在驱动基因。发现吸烟相关的DEGs确实在驱动基因中富集，而COPD或衰老相关的DEGs则没有（图3G）。在图3H的示意图中总结了关于单核细胞独特免疫作用的关键点，还利用最近发表的COPD scRNA-seq数据集验证了这些发现。基于优先考虑的细胞类型可能对疾病表型的反应或贡献最大，因此它们的状态在某种程度上可以作为揭示系统级异常的原因。与预期一致，炎症反应和细胞因子的产生在COPD相关的环境中更为普遍，通过MHC II类抗原呈递在吸烟相关的APC中更为活跃。特别的是，观察到在老化的结构细胞中通过MHC I类广泛激活抗原呈递，对应于老化单核细胞介导的Th1细胞反应的诱导（图3I）。总之，最优先的细胞类型，即单核细胞，在COPD发病机制中是一个关键的部分，特别是当衰老和吸烟严重参与时。
3、“COPD核心”病理:改变细胞间通讯和单核细胞对AT2s的促凋亡作用
在COPD相关单核细胞中，促炎信号通路的激活和细胞因子的产生表明，这种优先考虑的细胞类型可能通过细胞间通信驱动其他细胞类型的转录改变。因此，进行了连接组分析，以确定对照组和COPD肺之间细胞-细胞相关作用（CCIs）的差异。通过测量15种细胞类型中CellPhoneDB预测的配体-受体对数量的差异来量化CCIs的变化。总体而言，先天免疫细胞与非免疫结构细胞之间的CCIs增加，单核细胞中尤其明显（图4A）。然后将重点放在从对照组到COPD肺中预测配体-受体相互作用增加10%的CCI上，结果发现AT1和AT2都表现出与单核细胞的相互作用的增强最大（图4B）。一个关于单核细胞和肺泡上皮细胞间CCI增强的配体-受体对圆环图说明由于表达显著改变导致几种促炎因子在COPD相关单核细胞中上调，包括IL-1β、TNF和EREG（图4C）。为进一步探究单核细胞与肺泡上皮细胞相互作用的下游分子机制，作者进行了NicheNet分析，以优先考虑最能预测COPD相关肺泡上皮细胞中DEG的配体。在最优先的配体中，IL-1β和TNF被预测是有影响力的上游配体，可以调节两种肺泡上皮细胞类型中NF-κB和MAPK通路中的许多基因（图4D）。根据这一发现，metscape的上游分析预测，NF-κB、IL-1、TNF和MAPK信号通路中的几个转录因子可能调控AT1s和AT2s中识别的DEG（图4E）。总之，分析表明，COPD相关单核细胞中促炎信号通路的激活导致CCIs升高，特别是IL-1和TNF信号通路，可能是COPD肺泡上皮炎症的主要驱动因素。
为更好地表征信号拓扑，进行WGCNA分析，以寻找表达水平高度相关的COPD相关基因簇，并发现了一个被称为Blue模块的838个基因模块，其总体表达在COPD中显著上调（图4F, G）。使用富集图揭示了Blue模块主要生物过程的功能拓扑（图4H），包括外部刺激（细胞对化学刺激的反应），细胞损伤（凋亡过程和程序性细胞死亡），以及与图4E中预测的信号级联MAPK家族信号级联，强烈地将AT2s中的细胞损伤归因于IL-1β和TNF等促炎配体介导的单核细胞的外部免疫刺激。随后，利用STRINGDB为图4H中富集在2个以上生物过程中的Blue模块基因编码的蛋白构建了功能相互作用网络，以更好地展示与COPD相关的AT2s中的关键生物过程及其相互关系（图4I）。该网络清楚地表明，来自单核细胞的外部刺激，特别是以IL-1β和TNF为代表，通过内质网应激、线粒体功能障碍和MAPK信号通路导致AT2s凋亡，其中几个枢纽蛋白通过NF-κB信号通路连接（图4I）。综上所述，建立了“COPD核心”发病机制的信号通路，从单核细胞分泌促炎因子开始，通过CCIs传递信号，最终导致AT2s凋亡，抑制AT1s分化，从而导致肺泡上皮损伤后修复失败。
图4“COPD核心”病理：改变细胞间通讯和单核细胞对AT2s的促凋亡作用
4、衰老促进COPD发展的潜在机制:衰老的俱乐部细胞调节的自身免疫性气道小生境是气道上皮损伤的基础
由于俱乐部细胞是最优先考虑的衰老相关细胞类型（图2E和F），作者将注意力集中在俱乐部细胞上，以说明衰老可能促进COPD发展的潜在机制。热图列出了来自老年人和年轻人肺部的俱乐部细胞之间最大的生物学变化，揭示了衰老俱乐部细胞的一个独特的亚群，其特征是衰老，如蛋白质平衡的丧失（IRE1介导的未展开蛋白反应的调节）和细胞衰老（有丝分裂细胞周期的负调控），这些主要来自COPD肺样本（图5A）。值得注意的是，在所有4种类型的气道上皮细胞中，MHC I类抗原呈递途径的单细胞功能富集与细胞周期和IFN-γ介导的信号通路的负调控高度相关（图5B）。提示自身免疫易感性、IFN反应性和上皮细胞衰老与COPD病理之间的潜在联系。
IFN受体编码基因，包括IFNGR1、IFNGR2、IFNAR1和IFNAR2在气道上皮细胞中随着年龄的增长而显著增加（图5C）。MHC I系统的重要成分，尤其是B2M在老化的气道上皮细胞中普遍上调；FGFR2的表达在衰老的俱乐部细胞中下降（图5C）。鉴于俱乐部细胞是一种多功能的支气管肺泡上皮前体细胞，对气道上皮的维持具有重要意义，这种负相关性提高了衰老俱乐部细胞的自身免疫可能通过调节FGF信号通路而损害其干性的可能性。进一步鉴定了衰老俱乐部细胞特有的自身免疫倾向亚簇（图5D），并在COPD肺中富集（图5A），其中通过MHC I和IFN-γ介导的信号通路的抗原呈递被显著激活（图5E）。接下来，在解析从俱乐部细胞到其他上皮细胞的推断分化轨迹（图5F）后，发现在所有三种分化模式中，老年俱乐部细胞在早期阶段更加聚集，在自身免疫倾向的老年俱乐部细胞亚集群中更是如此（图5G）。由于数据显示细胞衰老和来自衰老肺部的非免疫结构细胞的自身免疫反应，作者通过分析CCI进一步研究了其他细胞类型是否以及如何参与这些过程。有趣的是，衰老的俱乐部细胞表现出与其他细胞类型最强的增强通信（图5H），这表明这种与衰老相关的优先级细胞类型在调节增加COPD易感的微环境中具有不可忽视的作用。因此，更深入地研究了负责增强俱乐部细胞和其他细胞类型之间CCIs的配体-受体对（图5I）。衰老的俱乐部细胞表现出增强的NOTCH2介导的与其他上皮细胞的相互作用（图5I）。总之，这些发现表明，在衰老过程中，自身免疫气道小位导致气道上皮细胞毒性损伤，这是由自身免疫诱导的IFN/MHC I轴触发的，由单核细胞进一步增强，并由衰老的俱乐部细胞调节。
图5衰老促进COPD发展的潜在机制：衰老的俱乐部细胞调节的自身免疫性气道小生境是气道上皮损伤的基础
5、吸烟促进COPD发展的潜在机制:巨噬细胞和内皮细胞之间有害的细胞间通信导致肺泡损伤
GSEA强调了AS患者肺中先天免疫细胞中通过MHC II类抗原提呈的激活（图3I）。其中巨噬细胞在AS患者中表现出最大的异质性，所以这种研究巨噬细胞。因此，基于前400个高度可变的GSVA术语，通过k-means聚类来解决异质性问题，并将巨噬细胞分为3个亚型(A、B和C)（图6A）。亚型A和B的GSVA富集分别在先天免疫反应和通过MHC II类抗原呈递中发挥作用，因此在很大程度上对应于巨噬细胞的稳态功能（图6B）。然而，亚型C通过参与线粒体电子传递的基因表达来区分（图6C），这表明该亚型具有独特的细胞代谢。作者发现AS肺的巨噬细胞中促炎鞘脂生物合成增强，抗炎鞘脂生物合成减少的证据，如吸烟肺中巨噬细胞SPTLC1、SPTLC2、CERS2、CERS5、ASAH1和SGPP1表达增加以及CERK和SMPD4表达减少（图6D）。此外，在C57BL/6小鼠的香烟烟雾提取物（CSE）处理的BMDMs中观察到这些基因的表达变化（图6E），进一步支持吸烟肺部巨噬细胞的促炎鞘脂生物合成。
作者设计了一种新的方法来推断吸烟巨噬细胞中激活的鞘脂生物合成对其他细胞类型的转录组改变的潜在贡献，该方法同时考虑了配体受体对介导的CCI，因为其他两种亚型的巨噬细胞参与了先天和适应性免疫反应（图6B）。简单地说，首先在个体水平上总结了细胞类型特异性基因的表达，然后检查了吸烟巨噬细胞中明显失调的鞘脂代谢酶以及上调的配体的表达是否与个体中其他细胞类型中吸烟相关的DEGs的变化一致（图6F）。发现，内皮细胞中吸烟相关的DEGs与巨噬细胞中上述失调的鞘脂代谢酶和配体的表达变化具有最高的一致性（图6G）。从图6H的Sankey图可以看出，巨噬细胞中与这些酶相关的基因之间富集的生物过程包括自噬、囊泡转运和内膜系统组织，而内皮细胞中富集的生物过程包括膜运输、细胞对脂质的反应和细胞骨架组织。提示促炎的鞘脂类代谢通信可能以囊泡形式从巨噬细胞传递到内皮细胞，并可能对吸烟肺中的两种细胞类型都有损害作用。巨噬细胞和内皮细胞中的几种酶及其高度相关基因如图6I所示。总的来说，这些发现表明吸烟引起的肺泡损伤是由APCs介导的，因为APCs增强了抗原呈递的能力，并以配体和鞘脂代谢物依赖的方式增强了巨噬细胞和内皮细胞之间的细胞间通信，这可能加重COPD。
图6吸烟促进COPD发展的潜在机制：巨噬细胞和内皮细胞之间有害的细胞间通信导致肺泡损伤
6、通过meta分析验证三种病理条件下的结果
考虑到COPD的高临床异质性和研究中肺组织样本的单中心来源，作者试图证实他们的发现，特别是在三种情况下（COPD，衰老，吸烟），以优先细胞类型为中心的系统级异常。为此，首先结合了来自不同年龄、种族和吸烟史的健康和COPD患者的9个样本的scRNA-seq数据集，组合成混合的9+9数据集。然后对9 + 9数据集重复下采样分析。再一次，在9 + 9数据集的共采样分析中，单核细胞和俱乐部细胞被优先考虑；COPD和衰老条件下的单核细胞和俱乐部细胞分别被优先考虑（图7A）。同样地，在9 + 9数据集的三种条件下，通过使用GSEA富集评分，测量了图3I中相同生物过程在所有细胞类型中的激活或抑制状态（图7B）。尽管9 + 9数据集并没有完全概括本数据集中每一个生物过程的状态，但这些数据集在慢性阻塞性肺病肺组织中单核细胞和AT2中普遍存在的炎症反应以及细胞因子产生方面有大量重叠，并且在老化肺组织中结构细胞中通过MHC I类抗原呈递的普遍激活以及DNA和端粒调控异常。由于吸烟影响的高度复杂性，吸烟条件下的生物过程状态比衰老和COPD条件下更不均匀，尽管在9 + 9数据集中，吸烟相关巨噬细胞中的鞘脂生物发生以及吸烟相关APCs中MHC II类介导的抗原呈递仍然突出。
总的来说，对已发表的scRNA- seq数据的综合分析表明，本研究发现的失调生物过程所反映的条件优先化细胞类型和系统级异常存在于具有不同遗传背景和临床背景的人群中，证实了本研究结果的可靠性和可重复性。
如图8所示，本研究表明“COPD核心”发病机制由单核细胞合成分泌促炎因子开始，经CCIs传播，最终导致肺泡上皮炎性损伤。在老年肺中，由干性衰竭的衰老俱乐部细胞调节的IFN/MHC I轴诱导的自身免疫性气道上皮生态位可能通过IFN-γ刺激因子IL18被单核细胞增强，并可能通过气道上皮细胞毒性损伤促进COPD发展。在吸烟条件下，巨噬细胞和内皮细胞之间依赖配体-受体相互作用和生物激活的鞘脂代谢产物增强的细胞间通信损害了肺内皮屏障，这可能加剧肺泡上皮的炎症破坏，同时伴随着通过先天性免疫细胞，包括单核细胞、DC、巨噬细胞和中性粒细胞，MHC II类抗原递呈能力的增加。
图8 使用来自人类的COPD肺单细胞图谱阐明COPD的病理模型示意图
参考文献：
Huang Qiqing., Wang Yuanyuan., Zhang Lili., Qian Wei., Shen Shaoran., Wang Jingshen., Wu Shuangshuang., Xu Wei., Chen Bo., Lin Mingyan., Wu Jianqing.(2022). Single-cell transcriptomics highlights immunological dysregulations of monocytes in the pathobiology of COPD. Respir Res, 23(1), 367. doi:10.1186/s12931-022-02293-2