RNA去甲基化酶ALKBH5通过ITPA m6A修饰促进t(8;21)急性髓系白血病的发生
染色体平衡易位t（8;21）是急性髓系白血病（AML）最常见的遗传畸变之一。即使t（8;21）患者被认为是低危AML，但仍有40~50%的患者接受单独化疗后不可避免地复发。KIT基因突变似乎是t（8;21）患者最常见的附加基因事件，预后较差。同种异体造血干细胞移植似乎是KIT突变患者的治疗方法，然而即使在接受治疗后，2年累积复发率也可接近32%，2年无白血病生存率仅为55%，这表明迫切需要开发更有效的治疗方法来改善患者的预后。该研究发表于《Biomarker Research》，IF：8.633。
技术路线：
主要研究结果：
1. ALKBH5在T（8;21）AML患者中过表达，是 Kasunmi-1细胞生长所必需的
与正常MNC相比，ALKBH5在mRNA水平上在t（8;21）AML患者中高表达（图1A）。作者的蛋白质印迹数据显示，ALKBH5在t（8;21）AML患者中的表达明显更高（图1B）。同样，与MNCs相比，Kasumi-5细胞中的ALKBH1蛋白水平更高（图1C）。此外，基于TCGA-LAML队列的ALKBH5升高与AML患者的总生存期缩短有关（图1D）。
为了研究ALKBH5在t（8;21）AML中的作用，在Kasumi-5细胞中构建了敲低ALKBH1细胞模型（图1E-F）。敲低ALKBH5能实质性抑制增殖（图1G-H）和显著诱导细胞凋亡（图1I和L）。敲低ALKBH5也显著抑制了人原发性AML细胞的生长（图1J），并促进人大块AML细胞的凋亡（图1K和M）。作者进一步检测了全局m6A水平并观察到ALKBH5敲低诱导Kasumi-1细胞和原代细胞中的水平显著增加（图1N)。
图1 ALKBH5是t（8;21）AML细胞生长所必需的
2. 敲低ALKBH5损害（8;21）AML维持
首先，RUNX1-RUNX1T1和套件N822Kmut共表达小鼠用作T（8;21）白血病小鼠模型。为了确定（5;8）AML维持是否需要ALKBH21，作者将ALKBH5 shRNA或对照shRNA转导到从 t（8;21）只白血病小鼠收集的t（8;21）白血病BM细胞中，并建立了BMT模型（图2A）。敲低ALKBH5显著抑制了体外菌落形成/重铺试验检测到的菌落数（图2B）。敲低ALKBH5显著损害了RUNX1-RUNX1T1和KIT的进展。N822Kmut-在受体小鼠中诱导t（8;21）AML（图2C）。作者观察到敲低ALKBH5显著抑制了转化供体细胞在外周血和BM中的植入（图2D-E），并减少脾脏和肝脏中白血病细胞的浸润（图2F-G）。接下来，作者使用异种移植模型（CDX和PDX）进一步评估ALKBH5在维持人类AML细胞中的潜在作用。正如预期的那样，敲低ALKBH5显著延长了异种移植受体小鼠的存活期，并抑制了BM中白血病细胞的植入（图2H-K）。
图2 敲低ALKBH5影响小鼠和人类AML的维持
3. 识别t（5;8）AML中ALKBH21的潜在靶标
为了探索 t（5;8）AML中ALKBH21功能的潜在机制，作者对Kasumi-5细胞中的 ALKBH1 敲低进行了转录组测序。在2326个shALKBH3和5个shNC样品中鉴定出3个差异表达基因（DEG），包括1533个下调基因和793个上调基因（图3A）。通过GO和KEGG通路富集分析，作者确定了包含凋亡信号通路的前10个GO术语和前5个KEGG术语（图3B-C），这与作者的发现一致，即敲低ALKBH5增加了Kasumi-1细胞的凋亡。然后，作者使用全局信号转导网络分析确定了关键的DEG（图3D）。
敲低ALKBH5显著降低了人AML细胞系、原代AML细胞和鼠RR/KIT AML细胞在两个转录处的ITPA水平（图4A）和蛋白质水平（图4B）。为了研究ITPA作为ALKBH5靶标的功能重要性，作者在操纵ALKBH5和ITPA表达时进行了细胞增殖和克隆形成实验（图4C），发现敲低ALKBH5对细胞生长的抑制作用在很大程度上可以通过ITPA的强制表达来挽救（图4D-E）。
图3 Kasumi-1细胞中ALKBH5的潜在靶点鉴定
图4 ITPA是ALKBH5功能重要的靶点
4. ALKBH5通过改变m6A修饰调控ITPA mRNA的稳定性
由于ITPA是ALKBH5的阳性靶标，也是增殖能力改变的驱动因素，作者接下来研究了ALKBH5对ITPA表达的调控机制。敲低ALKBH5可能会影响mRNA输出和RNA代谢，因此作者评估了ITPA mRNA的稳定性和亚细胞定位。敲低ALKBH5显著降低了Kasumi-1细胞中ITPA mRNA的半衰期（图5A），而似乎不影响ITPA RNA的核保留或输出（图5B）。此外，敲低ALKBH5不影响使用荧光素酶报告基因测定测定的ITPA启动子活性（图5C）。
为了确定ITPA mRNA是否是ALKBH5的底物，作者使用RNA免疫沉淀（RIP）结合qPCR测定。结果表明，与抗IgG抗体相比，抗ALKBH5抗体可以显著富集ITPA转录本（图5D）。此外，作者使用甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）结合qPCR来确定ITPA m6A ALKBH5敲低后的甲基化水平。与对照组相比，敲低ALKBH5增加了ITPA mRNA的水平（图5E）。野生型ALKBH5的过表达，但未报道的催化无活性突变体ALKBH5 H204A的过表达能够恢复ITPA表达（图5F），表明ALKBH5主要通过其去甲基化活性影响ITPA表达。总体而言，作者的RIP-qPCR和基因特异性m6A-qPCR证实ITPA与ALKBH5的强结合，并且与ALKBH6敲低后AML细胞的m5A丰度显著增加和预期表达水平变化相关。
图5 ALKBH5通过影响ITPA mRNA的稳定性来调控其表达
5. TCF15通过提高其启动子活性来调节ALKBH5表达
为了研究为什么ALKBH5在AML中高表达，作者专注于富含ALKBH5启动子的转录因子。作者从NCBI数据库中获得了ALKBH5启动子区，然后通过UCSC跟踪JASPAR分析鉴定了600个转录因子（图6A）。根据TCGA-LAML数据集，作者通过Pearson分析发现TCF15和NRF1与ALKBH5显著相关。作为一种已知的转录因子，TCF15对于多能性退出、造血干细胞（HSC）静止和HSC长期自我更新至关重要。然而，TCF15在AML中的作用尚不清楚。在AML患者中，耐药和复发与LSC/LIC的存在有关。由于Tcf15表达对HSC具有特异性，并且是HSC长期自我更新所必需的，作者推测TCF15是LSC/LIC自我更新所必需的。TCF15在CD34 LSC / LICs中表达，而不是CD34+−散装AML细胞（图6B）。此外，与CD5相比，ALKBH34在CD34 LSC / LICs中高表达+−散装AML细胞（图6C）。为了确定TCF15是否直接调控ALKBH5，作者进行了荧光素酶报告基因测定。潜在结合位点的缺失突变消除了TCF5过表达对ALHBH15启动子的反式活化（图6D-E）。TCF15敲低显著降低了LSC中ALKBH5和ITPA在转录和蛋白质水平上的表达（图6F-G）。
基于TCGA-LAML队列，TCF15表达较高的AML患者与较短的OS相关（图6H）。6ALKBH5敲低显著抑制了人类LSC/LICs的集落形成能力（图6I）。此外，TCF15敲低对细胞生长的抑制作用在很大程度上可以通过ALKBH5的强制表达来挽救（图6J）。总体而言，TCF15/ALKBH5/ITPA轴在t（8;21）AML的进展中起着至关重要的作用（图6K）。
图6 TCF15通过提高ALKBH5的启动子活性来调节其表达
结论：
该研究发现TCF15 / ALKBH5 / ITPA轴在AML发病机制和LSC / LIC维持中起着至关重要的作用。AML伴 t（8;21）预后良好，大多数患者进入缓解期，然而，大约一半患者复发，只有60%患者在诊断后存活超过5年。未来，通过靶向TCF15 / ALKBH5 / ITPA来消除LSC / LICs代表了治疗t（8;21）AML患者的有前途的治疗策略。
参考文献：
Li R, Wu X, Xue K, Feng D, Li J, Li J. RNA demethylase ALKBH5 promotes tumorigenesis of t (8;21) acute myeloid leukemia via ITPA m6A modification. Biomark Res. 2023 Mar 10;11(1):30. doi: 10.1186/s40364-023-00464-x.