PHB2通过对抗PKM2剪接维持VSMCs的收缩表型

血管平滑肌细胞(VSMCs)的表型转变是多种血管疾病早期的发病机制。代谢重编程可能参与VSMC表型转变。然而，将能量代谢与不同VSMC表型联系起来的确切分子仍然难以捉摸。我们利用基因本体注释收集细胞能量调节基因，并对转化生长因子-β或血小板衍生生长因子BB刺激的VSMCs进行RNA-Seq分析。prohibitin2缺乏的VSMCs失去了可收缩的表型，这可以通过减少可收缩蛋白来证明。与Phb2^flox/flox小鼠相比，Phb2^SMCKO小鼠更容易损伤后VSMC增殖和新内膜形成。进一步的蛋白质相互作用组分析、免疫共沉淀和哺乳动物2-杂交实验显示，prohibitin 2通过其C端直接与丙酮酸激酶M1/2 (PKM) mRNA拼接的关键调节因子hnRNPA1相互作用，促进PKM2表达和糖酵解。Prohibitin2缺失促进PKM1/2 mRNA剪接和PKM1向PKM2的逆转，并增强VSMCs的糖酵解。阻断2-hnRNPA1相互作用导致PKM2表达增加，糖酵解增强，VSMCs中收缩标记基因表达抑制，以及体内损伤后新内膜形成加剧。总之，Prohibitin 2通过与hnRNPA1相互作用来抵消hnRNPA1介导的PKM选择性剪接和葡萄糖代谢重编程来维持VSMC的收缩表型。本文于2022年10月发表于Circulation Research (IF=23.213)。

技术路线：

结果：

(1) RNA序列分析预测新的将能量稳态与VSMCs收缩表型联系起来的候选基因

为了识别连接细胞能量代谢和VSMC表型的新候选基因，我们首先进行了RNA-seq分析，以揭示转化生长因子-β (TGF-β)处理增强收缩表型相关基因表达或血小板衍生生长因子BB (PDGF-BB)处理降低收缩表型相关基因表达的原发性大鼠VSMC的转录组变化。在这1893个基因中，有6个基因与细胞能量调节基因数据库重叠，包括prohibitin 2 (PHB2)、瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员4 (TRPV4)、ALK酪氨酸激酶受体(ALK)、组蛋白赖氨酸n-甲基转移酶PRDM16(PRDM16)、乙酰辅酶a羧化酶2 (ACACB)和载脂蛋白C-III (APOC3)(图1A)。接下来，我们验证了mRNA水平，发现原发性大鼠VSMCs中PHB2、TRPV4和ALK的表达确实受到TGF-β和PDGF-BB的相互调节(图1B)。接下来，我们使用靶向Phb2、Trpv4和Alk的特异性小干扰RNA (siRNAs)检测VSMC收缩标志物(ACT A2、CNN1和SM22α)的mRNA水平。如图1C所示，沉默Phb2、Trpv4和Alk可导致VSMC收缩标志物的表达显著降低，提示这3个基因可能是连接VSMC能量代谢与收缩表型的候选基因。在这3个基因中，有报道称prohibitin 2与prohibitin 1共同调控线粒体中的细胞色素-c氧化酶组装和线粒体呼吸。然而，prohibitin 2在VSMC身份和血管稳态中的确切作用仍然未知。另外的免疫荧光分析显示，prohibitin2主要定位于人动脉介质层(图1D)。因此，我们探讨了prohibitin 2是否调控VSMC表型。

图1：RNA序列分析预测了连接血管平滑肌细胞(VSMC)能量稳态和收缩表型的新候选基因

(2) Prohibitin2减少与VSMCs转分化相关

进一步的Western blotting分析显示，在原发大鼠VSMCs中，PDGF-BB刺激后，prohibitin 2蛋白水平与VSMCs收缩标记物同时降低(图2A)。相反，TGF-β刺激的VSMCs表现出更高水平的prohibitin 2和收缩标志物(图2B)。血清饥饿是触发VSMC表型从去分化状态向分化状态转变的典型刺激。血清饥饿VSMCs中prohibitin 2水平升高(图2C)。RT-qPCR分析证实，在人类VSMCs中也观察到类似的改变(补充图未展示)。值得注意的是，在VSMCs表型转化过程中，prohibitin-1蛋白水平无统计学差异(图2A-2C)。同样，与假手术动脉相比，球囊损伤后3、7和14天，大鼠颈动脉中prohibitin 2的表达显著降低，同时VSMCs收缩标记物减少，内膜面积增加(图2D)。因此，western blotting分析、RT-qPCR和免疫荧光分析表明，与对照组乳腺内动脉相比，颈动脉内膜切除术患者动脉中prohibitin2的表达明显降低(图2E-2G)。

图2：Prohibitin 2减少与血管平滑肌细胞(VSMC)去分化相关

(3) Prohibitin 2在体外维持VSMCs的收缩表型

我们探讨了prohibitin2表达的干扰是否会影响VSMC表型切换。siRNA介导的人VSMCsprohibitin 2沉默可导致收缩标记物水平降低(补充图未展示)。因此，TGF-β促进VSMCs收缩蛋白表达的上调通过prohibitin 2沉默被取消(图3A)。为了进一步确定prohibitin 2在体内VSMC表型中的确切作用，将Phb2^flox/flox小鼠与Tagln-Cre小鼠杂交，构建VSMC特异性Phb2缺失小鼠(Phb2^SMCKO小鼠)(补充图未展示)。与Phb2^flox/flox小鼠(WTVSMCs)相比，Phb2^SMCKO小鼠的原发性VSMCs (Phb2 KO VSMCs)中的VSMCs收缩标记物的mRNA和蛋白质水平明显降低(图3B)。F-actin染色显示，prohibitin 2沉默导致原发大鼠VSMCs从细长收缩形态转变为多边形合成形态(图3C)。此外，经Phb2siRNA转染的VSMCs与经siRNA打乱转染的VSMCs相比，收缩能力降低，胶原凝胶收缩试验证明了这一点(siRNA打乱与siRNAPhb2: 46.3±3.86% vs 71.2±4.35%，P<0.05)(图3D)。从Phb2^SMCKO小鼠中分离出的主动脉环对苯肾上腺素的反应表现出收缩力减弱(图3E)。在siRNAPhb2转染的VSMCs中，细胞迁移活性也增加了，划伤实验和Boyden室实验证明了这一点(图3F和3G)。相反，prohibitin 2过表达2可挽救PDGF-BB诱导的VSMC收缩标记物减少和VSMC迁移(补充图未展示)。综上所述，这些数据表明禁用2是维持VSMCs收缩表型的关键。

图3：Prohibitin 2在体外维持血管平滑肌细胞(VSMCs)的收缩表型

(4) VSMCs中Prohibitin 2的缺乏加剧体内损伤后新生内膜形成

对12周大的雄性Phb2^SMCKO小鼠和Phb2^flox/flox小鼠进行颈动脉钢丝损伤。颈动脉MYH11 (VSMC标记物)和CD31 (EC标记物)免疫染色显示，术后第0天，Phb2^SMCKO小鼠和Phb2^flox/flox小鼠的钢丝损伤程度相同(补充图未展示)。与Phb2^flox/flox动脉相比，钢丝损伤后第3、5和7天，Phb2^SMCKO动脉中VSMC收缩标记物的表达减少，尽管新内膜形成没有那么明显的诱导(图4A)。相反，损伤后14天，通过BrdU染色观察到Phb2^SMCKO动脉细胞增殖活性增强(图4B)。结果，Phb2^SMCKO小鼠的新内膜明显大于Phb2^SMCKO小鼠(图4C)。此外，Phb2^SMCKO动脉新内膜与中膜的比例远高于Phb2^flox/flox动脉，而中膜面积和外弹性层周长在两组间无统计学差异。此外，为了排除taglncre介导的Phb2敲除可能引起的胚胎发育影响，我们将Phb2floxflox小鼠与Myh11-CreERT2小鼠杂交(补充图未展示)。然后，8周龄雄性Phb2^flox/flox小鼠和Phb2^flox/floxMyh11-CreERT2小鼠用他莫西芬诱导出生后VSMCs的抑制性2耗尽。两组小鼠(Phb2^flox/flox+他莫西芬和Phb2^flox/floxMyh11-CreERT+他莫西芬)颈动脉钢丝损伤。与他莫昔芬处理的Phb2^flox/floxMyh11-CreERT2小鼠相比，他莫昔芬处理的Phb2^flox/flox/flox小鼠线损伤诱导的新内膜形成显著增加(图4D)。因此，prohibitin 2在体内维持VSMCs的收缩表型。

图4：体内血管平滑肌细胞(VSMCs)的Prohibitin 2缺乏加剧损伤后新内膜的形成

(5) HnRNPA1是一种新的Prohibitin2结合蛋白

我们使用原发大鼠VSMCs来探索连接prohibitin 2和VSMCs表型调制的潜在结合伙伴。3个蛋白条带被抗prohibitin 2抗体特异性免疫沉淀，而不是对照IgG。14个被抗prohibitin 2抗体免疫沉淀而非对照IgG免疫沉淀的蛋白被鉴定为潜在的prohibitin 2结合伙伴，包括prohibitin1 (PHB1)、异质核核糖核蛋白A1 (hnRNPA1)、颗粒蛋白(GRN)、PRMT1蛋白染色质靶蛋白(CHTOP)、14-3-3蛋白zeta (YWHAZ)、srsf1、膜联蛋白A2 (ANXA2)等(图5A)。我们首先分析了prohibitin2缺乏是否会导致hnRNPA1表达的改变。在钢丝损伤小鼠颈动脉中，hnRNPA1的表达减少。因此prohibitin 2对hnRNPA1的表达没有调控作用。接下来我们评估了prohibitin 2和hnRNPA1的潜在相互作用。在原代大鼠VSMCs的细胞裂解液中，内源性prohibitin 2与抗hnRNPA1抗体共免疫沉淀，但不与对照IgG共免疫沉淀，反之亦然(图5B)。进一步的共免疫沉淀分析显示，prohibitin 2与抗hnRNPA1抗体共免疫沉淀，但与对照IgG未在原代大鼠VSMCs的核部分共免疫沉淀，但在细胞质部分不共免疫沉淀，这表明prohibitin 2-hnRNPA1相互作用发生在细胞核(图5C)。hnRNPA1和prohibitin2一致地共定位于原发性大鼠VSMCs的细胞核(图5D)。HEK293A细胞分别转染hnRNPA1 FL/ΔM9/ΔRGGbox-M9质粒旁的pcDNA3.1-6×his-prohibitin 2质粒和flag-CMV质粒(图5E)，然后使用抗flag抗体进行共免疫沉淀分析。hnRNPA1 FL和hnRNPA1ΔM9突变体均通过标志抗体特异性免疫沉淀出prohibitin 2，而不是对照IgG(图5F)。hnRNPA1的RGG-box结构域与prohibitin 2结合(图5G)。接下来，我们亚克隆了prohibitin 2的不同结构域(图5H)。Flag-hnRNPA1通过抗flag抗体特异性免疫沉淀prohibitin 2的C端，但不通过对照IgG，反之亦然(图5I)。通过哺乳动物2-杂交实验验证了prohibitin 2与hnRNPA1的C端相互作用(图5J)。总之，通过其C端，prohibitin 2直接与hnRNPA1的RGG-box结构域相互作用。

图5：异质核核糖核蛋白A1 (HnRNPA1)是一种新型的prohibitin 2结合蛋白

(6) HnRNPA1-Prohibitin 2相互作用对维持VSMC体内外收缩表型至关重要

我们研究核内prohibitin 2和hnRNPA1的相互作用是否对VSMC的收缩表型至关重要。将带有C端M9结构域的hnRNPA1的RGG-box结构域亚克隆到腺病毒pAdT机架-CMV载体中，重组腺病毒(Ad-Flag-RGG-M9)用于阻断hnRNPA1和prohibitin2的核相互作用。免疫共沉淀实验显示，Ad-Flag-RGG-M9感染显著阻断了原发大鼠VSMCs中prohibitin 2-hnRNPA1相互作用(图6A)。Ad-FlagRGG-M9感染抑制了α-actin和SM22α的转录活性，从而导致VSMCs去分化和细胞迁移增加(图6B-6E)。Ad-Flag-RGG-M9感染加剧了球囊损伤后第7天VSMC收缩标记物的减少和新内膜形成的诱导(图6F)。Ad-Flag-RGG-M9感染加重了大鼠球囊损伤模型28天新生内膜的形成(图6G)，而不会导致体重或血压等显著变化。免疫染色实验证明，与假手术Ad-GFP感染大鼠颈动脉相比，球囊损伤Ad-GFP感染大鼠颈动脉VSMCs中prohibitin 2水平显著降低(补充图未展示)。在Ad-Flag-RGG-M9感染的大鼠颈动脉中，与Ad-GFP感染的大鼠颈动脉相比，prohibitin 2的水平没有改变，这表明prohibitin 2-hnRNPA1相互作用不可能调控prohibitin 2的表达(补充图未展示)。综上所述，这些数据揭示了prohibitin 2-hnRNPA1相互作用对VSMC收缩表型维持的重要作用。

图6：HnRNPA1-prohibitin 2相互作用对于维持血管平滑肌细胞(VSMCs)在体内外的收缩表型至关重要

(7) Prohibitin 2抑制hnRNPA1介导的pre-PKM mRNA剪接、PKM2表达和有氧糖酵解

hnRNPA1是pre-PKM mRNA剪接的主调控因子。PKM2是PKM的首选剪接异构体，调节糖酵解的最终限速步骤，而PKM1促进OXPHOS。这两种异构体来自于PKM前mRNA的互排性选择性剪接，反映了外显子9 (PKM1)或外显子10 (PKM2)的包含。hnRNPA1抑制外显子9的序列侧翼，导致外显子10的包含和PKM2的表达。我们研究prohibitin 2是否影响hnRNPA1介导的pre-PKM mRNA剪接、PKM2的产生和有氧糖酵解。与Phb2^flox/flox小鼠(WTVSMCs)相比，从Phb2^SMCKO小鼠分离的原发性小鼠VSMCs (Phb2 KO VSMCs)中PKM2的mRNA水平升高，而PKM1的mRNA水平下降(补充图未展示)。相比之下，pre-PKM mRNA水平没有显著改变，表明存在另一种剪接。PstI和NcoI酶切扩增子后进一步RTPCR显示Phb2缺失促进PKM1向PKM2的反式表达(图7A)。在Phb2 KO原发小鼠VSMCs(图7B)、Ad-Flag-RGG-M9感染的大鼠VSMCs(图7C)以及感染Ad-Flag-RGG-M9的球囊损伤大鼠颈动脉中使用western blotting也观察到了类似的结果。Phb2 KO VSMCs糖酵解活性增强，OXPHOS活性降低，细胞糖酵解和有丝分裂应激试验证明(图7D)。PDGF-BB刺激的原发大鼠VSMCs中prohibitin 2被抑制的转分化通过PKM2过表达被取消(图7E)。为了进一步阐明prohibitin2是否在体内通过抑制PKM2的表达来维持VSMC的收缩表型和对抗新生内膜的形成，我们使用带有SM22α启动子的AAV9载体选择性下调VSMC中的PKM2。在Phb2^SMCKO小鼠颈动脉钢丝损伤后第7天，VSMC特异性PKM2耗损挽救了VSMC收缩标记物的减少(补充图未展示)。Phb2^SMCKO小鼠钢丝损伤后血管收缩力下降和新生内膜形成增强均因VSMC特异性PKM2耗损而得到挽救(图7F-7G)。综上所述，prohibitin2与核hnRNPA1直接相互作用，抑制hnRNPA1介导的pre-PKM mRNA剪接和PKM2的产生，从而调节葡萄糖代谢重编程，在体外和体内维持VSMCs的收缩表型。

图7：Prohibitin2抑制hnRNPA1介导的pre-PKM mRNA剪接、丙酮酸激酶异构体M2 (PKM2)表达和葡萄糖代谢重编程

结论：

Prohibitin2通过直接与核hnRNPA1相互作用，抑制hnRNPA1介导的pre-PKM mRNA剪接、PKM2的产生，从而调节葡萄糖代谢重编程(图8)，维持VSMCs的收缩表型，抑制损伤后新内膜的形成。Prohibitin2是维持VSMCs稳态的内源性糖酵解调节剂。以prohibitin2-hnRNPA1-PKM2轴为靶点调节VSMC能量代谢可能有助于心血管疾病的治疗。

图8：Prohibitin2在血管平滑肌细胞(VSMC)表型测定的示意图

参考文献：

Jia, Y., Mao, C., Ma, Z., Huang, J., Li, W., Ma, X., Zhang, S., Li, M., Yu, F., Sun, Y., Chen, J., Feng, J., Zhou, Y., Xu, Q., Zhao, L., Fu, Y., & Kong, W. (2022). PHB2 Maintains the Contractile Phenotype of VSMCs by Counteracting PKM2 Splicing. Circulation research, 131(10), 807–824. https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.122.321005.