全基因组CRISPR筛选发现DOCK1抑制和二甲双胍在肝癌中的合成致命性

二甲双胍是多种癌症强有力的候选抗肿瘤药物。然而它的抗肿瘤效果在不同的癌症或亚群中有所不同，这可能是由于肿瘤的异质性。目前尚不清楚哪些肝细胞癌(HCC)患者亚群可以从二甲双胍治疗中受益。通过基于CRISPR-Cas9的全基因组敲除筛选，我们发现DOCK1水平决定了二甲双胍的抗肿瘤作用，并且DOCK1是二甲双胍在HCC中的合成致死靶点。在机制上，二甲双胍促进DOCK1磷酸化，激活RAC1促进细胞存活，导致二甲双胍耐药。DOCK1选择性抑制剂TBOPP通过二甲双胍增强体外肝癌细胞系和患者来源的HCC类器官的抗肿瘤活性，并在体内异种移植的肝癌细胞和免疫能力强的小鼠肝癌模型中增强抗肿瘤活性。二甲双胍可以改善DOCK1低水平HCC患者的总生存期，但对DOCK1高表达患者没有改善作用。这项研究表明，二甲双胍的有效性取决于DOCK1的水平，二甲双胍联合DOCK1抑制可能为二甲双胍耐药的HCC患者提供一种有前途的个性化治疗策略。本文于2022年11月发表于Protein&Cell(IF=15.328)。

技术路线：

结果：

(1) CRISPR-Cas9文库筛选确定DOCK1为二甲双胍敏感性的决定因素

为了系统地识别对二甲双胍治疗敏感的肝癌亚型，我们采用了基于CRISPR-Cas9的负选择方法来筛选那些损失会增强二甲双胍抗肿瘤作用的基因。在二甲双胍存在或不存在的情况下，用含有基因组级CRISPR敲除文库(GeCKOv2)的慢病毒转染的PLC/PRF/5细胞(PLC)进行培养。孵育两周后，基因组DNA被分离出来，高通量测序用于确定引导RNA的丰度，然后用MAGeCKFlute进行进一步分析(图1A)。然而，在二甲双胍治疗组中，398个基因显著减少(差异beta评分<−0.3)(图1B)。为了确定哪些基因可能使PLC细胞对二甲双胍敏感，但在未处理的细胞中没有表现出明显的生长障碍，我们使用对照组β-评分变化不超过0.15(−0.15<对照组β-评分<0.15)的附加标准缩小了候选基因。根据这一标准，398个基因中有171个被确定为候选基因(图1C)，最终选择其中6个进行进一步分析。

接下来，为了验证筛选结果，我们定量了这6个候选细胞的mRNA表达，并测定了二甲双胍在9种肝癌细胞中的半最大抑制浓度(IC50)值(图1D和1E)。相关分析显示DOCK1表达与二甲双胍IC50值和AUC评分的Pearson相关系数最高(图1F)，提示DOCK1表达水平可能决定了肝癌细胞对二甲双胍的敏感性。考虑到高差异beta评分及其与二甲双胍反应的强相关性，我们将重点放在DOCK1上进行进一步研究。

对指导RNA的分析显示，在二甲双胍处理的细胞中，所有六种靶向DOCK1的sgRNAs的丰度都较低(补充图未展示)。与这些结果一致，DOCK1敲低导致PLC细胞在长期集落形成实验和IC50检测中显着敏化，以分析短期细胞活力(图1G)。DOCK1的异位表达减弱了shDOCK1诱导的PLC细胞的二甲双胍敏感性(图1H)。此外，DOCK1的过表达消除了二甲双胍在Huh7细胞中的抗肿瘤作用(图1I)。综上所述，这些结果表明DOCK1的表达水平决定了肝癌细胞对二甲双胍的敏感性。

图1：CRISPR-Cas9文库筛选确定DOCK1为二甲双胍敏感性的决定因素

(2) 抑制DOCK1使肝癌细胞在体内和体外对二甲双胍敏感

为了进一步描述DOCK1在临床前模型中确定二甲双胍敏感性中的作用，我们建立了四种患者来源的HCC类器官(即1T、2T、3T和4T)用于进一步的体外分析。进一步的免疫组化染色显示DOCK1在所有四个类器官及其相应的肿瘤组织中表达一致(图2A)。免疫组化染色和Western blot均显示类器官1T和2T的DOCK1表达明显高于3T和4T(图2A和2B)。

为了研究HCC类器官对二甲双胍的反应，我们用增加剂量的二甲双胍治疗四个类器官。在二甲双胍处理下，类器官3T和4T的类器官数量和大小比1T和2T减少得更多(图2C)，表明敏感性更高，3T和4T的IC50值更低(图2D)证实了这一点。为了研究DOCK1表达是否确实决定了患者来源的类器官中二甲双胍的敏感性，我们在类器官1T和2T中通过shRNAs敲除DOCK1。与我们在PLC细胞中的观察结果一致，DOCK1敲除在这些患者来源的HCC类器官中诱导二甲双胍敏感性(图2E-G)。此外，Ki67免疫荧光染色显示，在DOCK1敲低的情况下，二甲双胍能强烈抑制HCC类器官2T的增殖(补充图未展示)。综上所述，DOCK1表达水平有助于确定患者来源的HCC类器官的二甲双胍敏感性。

为了研究这些体外研究结果是否可以在体内重现，我们采用了YAP5SA诱导的HCC模型。为建立该模型，采用水动力注射法将单转座子YAP5SA和shDOCK1(或非靶向对照，NTC)表达质粒注入小鼠体内。在一个月的生长后，小剂量的二甲双胍(100mg/kg)每天口服给这些小鼠三个月。在NTC组中，低剂量二甲双胍对肿瘤生长没有影响，而在shDOCK1组中，该剂量二甲双胍可显著降低肝癌发病率，抑制肿瘤生长(图2H)。与这些结果一致，Ki67免疫组化染色显示二甲双胍治疗显著抑制了表达shDOCK1的HCC肿瘤的增殖(补充图未展示)。Western blot分析证实YAP1在肿瘤组织中过表达，DOCK1表达下调(图2I)。此外，使用DOCK1敲低的PLC细胞进行的小鼠异种移植实验表明，抑制DOCK1会增强二甲双胍的抗肿瘤作用(图2J、2K)。总的来说，DOCK1水平调节二甲双胍对肝癌的抗肿瘤作用的强度，而在体外和体内小鼠模型中，抑制DOCK1可使肝癌对二甲双胍敏感。

图2：抑制DOCK1使肝癌细胞在体内和体外对二甲双胍敏感

(3) RAC1激活导致DOCK1介导的癌细胞对二甲双胍不敏感

为了探索DOCK1缺乏如何增强二甲双胍的抗肿瘤作用，我们对表达NTC或shDOCK1的PLC细胞(PLC-NTC, PLC-shDOCK1细胞)在二甲双胍存在或不存在的情况下进行RNA-seq。在NTC细胞中，二甲双胍改变了935个基因的表达，其中一些基因进一步受到DOCK1抑制的影响(图3A)。为了全面解释DOCK1在二甲双胍介导的癌症抑制中的作用，我们分析了三组基因，包括NTC细胞中二甲双胍上调的基因，以及相对于二甲双胍处理的NTC细胞，在存在或不存在二甲双胍时，shDOCK1下调的基因。这三组基因在功能上有大量的重叠(图3B)。进一步的基因本体(GO)和通路富集分析揭示了所有三组共有的18个GO术语或通路(图3C)。在18个GO术语中，有4个术语与小的GTPase活性有关(图3D)，这表明小的GTPase活性通路可能参与了DOCK1抑制诱导的癌细胞对二甲双胍的增敏。

我们重点研究了RAC家族小GTPase信号转导通路。RAC与GTP结合时是活跃的，与GDP结合时是不活跃的。敲除DOCK1显著降低了RAC1-GTP的水平。RAC1在细胞骨架组装、肿瘤发生和肿瘤增殖中发挥重要作用，因此我们假设DOCK1缺乏通过抑制RAC1激活使癌细胞对二甲双胍敏感。

Western blot显示，二甲双胍处理可导致PLC细胞中RAC1的激活，可见二甲双胍存在时RAC1-GTP水平升高(图3E)。在DOCK1敲低细胞中，二甲双胍介导的RAC1激活被消除，这表明DOCK1是二甲双胍激活RAC1所必需的(图3F)。DOCK1的DOCK同源区-2(DHR2)结构域直接与无核苷酸的RAC相互作用，诱导RAC的GTP负载，从而促进其活化。因此，DHR2结构域的缺失导致DOCK1功能的丧失。为了进一步阐明shDOCK1是否通过其典型的GEF功能使癌细胞对二甲双胍敏感，我们在内源性DOCK1敲除的PLC细胞中异位表达携带DHR2结构域缺失(DOCK1^△DHR2)的DOCK1。

为了进一步测试RAC1激活是否对shDOCK1介导的二甲双明敏化至关重要，我们在PLC-shDOCK1细胞中过表达野生型RAC1或RAC1G12V突变体(RAC1的组成活性形式)(图3G)。集束形成实验显示，RAC1G12V的表达部分减弱了PLC-shDOCK1细胞中增强的二甲双胍敏感性，而野生型RAC1在PLC-shDOCK1细胞中仅显示出可忽略的影响(图3H)，这表明RAC1的激活有助于shDOCK1介导的癌细胞二甲双胍敏化。

实时定量PCR(qPCR)和Western blot分析显示，二甲双胍对DOCK1的RNA或蛋白表达均无影响(图3E)。二甲双胍处理导致DOCK1酪氨酸残基磷酸化增强(图3I)，这增加了DOCK1的GEF活性。为了确定哪些特定的DOCK1酪氨酸残基在暴露于二甲双胍时被磷酸化，我们构建了含有Y722F和Y1811F双突变体的DOCK1Y722F/Y1811F质粒。Western blot结果显示，与野生型DOCK1相比，二甲双胍诱导的酪氨酸磷酸化在DOCK1Y722F/Y1811F变体中显著降低(图3J)，这表明DOCK1Y722和Y1811残基确实是二甲双胍调控的磷酸化位点。

我们在PLC-shDOCK1细胞中异位表达了野生型DOCK1或DOCK1Y722F/Y1811F。Western blot结果显示，二甲双胍在表达野生型DOCK1的细胞中促进了RAC1的激活，但在表达DOCK1Y722F/Y1811F突变体的细胞中没有，这表明二甲双胍激活RAC1需要在DOCK1的Y722和Y1811残基磷酸化(图3K)。DOCK1Y722F/Y1811F突变体的共表达也未能减弱shDOCK1诱导的癌细胞对二甲双胍治疗的致敏性(图3L)。综上所述，二甲双胍在DOCK1的磷酸化中起作用，导致RAC1的激活，DOCK1的缺乏使癌细胞对二甲双胍敏感。

图3：通过DOCK1磷酸化激活RAC1有助于癌细胞对二甲双胍不敏感

(4) TBOPP与二甲双胍在体内外的协同作用

1-(2-(30-(三氟甲基)-[1,10-联苯]-4-基)-2-氧乙基)-5吡咯烷基磺酰-2(1H)-吡啶酮(TBOPP)是DOCK1的选择性抑制剂。为了探索靶向DOCK1-RAC1轴的治疗潜力，我们测试了TBOPP对癌细胞二甲双胍毒性的影响。在0.75μmol/L或1μmol/L剂量下，TBOPP显著抑制了RAC1的激活，但对PLC细胞的活力没有影响(补充图未展示)。然而，当1mmol/L二甲双胍与0.75µmol/L或1µmol/L TBOPP联合处理PLC细胞时，在降低细胞活力方面有很强的协同作用(图4A)。Western blot检测RAC1-GTP显示，在PLC细胞中，TBOPP减弱了二甲双胍诱导的RAC1激活(图4B)。我们分别使用1.5 μmol/L和7.5 μmol/LTBOPP联合二甲双胍治疗类器官1T和2T。结果显示，二甲双胍或TBOPP单独仅轻微抑制患者来源的HCC类器官的生长和增殖，而它们的联合治疗显著降低了两种HCC类器官的细胞活力(图4C)，这表明二甲双胍和TBOPP联合使用具有强大的协同致死性。

接下来，我们使用PLC细胞进行了小鼠异种移植实验。我们在后续实验中选择了8 mg/kg TBOPP剂量，以探讨其与二甲双胍的联合作用。8 mg/kg TBOPP联合100 mg/kg二甲双胍可显著抑制PLC异种移植瘤生长，且不影响小鼠体重，进一步证实了TBOPP与二甲双胍的抗肿瘤协同作用(图4D)。肿瘤组织裂解物的Western blot分析显示，TBOPP治疗明显抑制二甲双胍诱导的RAC1激活(图4E)，这证实了RAC1激活有助于体内癌细胞对二甲双胍的DOCK1抑制相关的增敏。

为了进一步证实TBOPP和二甲双胍之间的协同作用，我们采用NRASG12V/shP53诱导的原位肝癌模型。二甲双胍或TBOPP单药治疗只能提供适度的肿瘤抑制，而联合治疗在NRASG12V/shP53诱导的小鼠肝癌模型中具有很强的肿瘤抑制作用(图4F)。我们使用Ki67染色进一步证实了不同治疗方法在肿瘤增殖方面的差异(图4G)，Western blot显示TBOPP在NRASG12V/shP53诱导的原位HCC模型中消除了二甲双胍介导的RAC1激活(图4H)。总的来说，在体外和体内的几个模型中，DOCK1抑制剂TBOPP与二甲双胍在抑制肝癌方面产生了强烈的协同效应。

图4：TBOPP与二甲双胍在体内外的协同作用

(5) DOCK1水平决定肝癌患者中二甲双胍的抗肿瘤活性

我们通过对122例临床HCC合并糖尿病患者的回顾性评估，试图确定DOCK1表达水平是否可以作为评估二甲双胍在肝癌患者治疗效果的潜在生物标志物。这些患者被分为二甲双胍使用组和其他抗糖尿病药物使用组。我们进行免疫组化染色以可视化和定量DOCK1的表达，并根据DOCK1的平均强度将患者分为DOCK1^Low(n=66)和DOCK1^High (n=56)两类。二甲双胍似乎能显著提高DOCK1^Low患者的总生存期(图5A)，而相比之下，二甲双胍治疗与DOCK1^High患者的不良预后相关(图5B)。这些结果表明，二甲双胍对患者的治疗效果明显相反，这取决于DOCK1水平是否相对低或高。对使用二甲双胍的糖尿病HCC患者的进一步分析显示，DOCK1水平低的患者总生存率更好(图5C)。在二甲双胍治疗的糖尿病HCC患者的样本中，Ki67染色显示，与DOCK1^High组相比，DOCK1^Low组的Ki67阳性细胞比例更低(图5D)。综上所述，DOCK1水平决定了二甲双胍在HCC患者中的抗肿瘤效果。

为了验证这种可能性，我们接下来研究了DOCK1在HCC患者中的表达水平。肝癌标本中DOCK1免疫组化染色定量分析显示，肿瘤组织中DOCK1较邻近正常组织上调(图5E)。qPCR和Western blot分析显示，与匹配的相邻非癌性肝组织相比，HCC组织中DOCK1的RNA和蛋白质水平均升高(图5F和5G)。

DOCK1的高表达提示HCC患者二甲双胍的疗效可能较差。尽管DOCK1在HCC患者中广泛表达上调，但肿瘤的异质性仍然导致DOCK1在HCC样本中的差异积累，一些患者表现出非常低的，甚至无法检测到的DOCK1水平(图5F)。这一发现进一步表明，HCC患者应根据其特定的DOCK1水平，强烈考虑采用个性化的精准医疗方法。综上所述，DOCK1在HCC中上调，其上调程度可决定二甲双胍的抗肿瘤效果。

图5：DOCK1水平决定肝癌患者中二甲双胍的抗肿瘤活性

结论：我们的研究强调了DOCK1在决定肝癌细胞对二甲双胍治疗反应中的作用，并说明了二甲双胍在DOCK1低表达的肝癌患者中抑制肿瘤进展。二甲双胍-DOCK1抑制剂联合治疗DOCK1高表达肝癌患者的潜在有效性，这值得进一步的临床研究(图6)。

图6：工作模型：DOCK1通过DOCK1/RAC1轴决定二甲双胍的抗肿瘤活性。

参考文献：

Feng, J., Lu, H., Ma, W., Tian, W., Lu, Z., Yang, H., Cai, Y., Cai, P., Sun, Y., Zhou, Z., Feng, J., Deng, J., Shu, Y., Qu, K., Jia, W., Gao, P., & Zhang, H. (2022). Genome-wide CRISPR screen identifies synthetic lethality between DOCK1 inhibition and metformin in liver cancer. Protein & cell, 13(11), 825–841. https://doi.org/10.1007/s13238-022-00906-6.