胰腺褪黑素通过调节肿瘤相关中性粒细胞浸润和NETosis来增强胰腺腺癌的抗肿瘤免疫

动物实验，细胞增殖测定，酶联免疫吸附，蛋白质阵列，免疫印迹，免疫荧光，定量 RT-PCR，HE染色，流式细胞术，活体成像

胰腺癌（PAAD）是2020年男性和女性第7大死亡原因，死亡率/发病率极高。由于缺乏早期症状和异常侵袭性的发展，其5年生存率仍然不令人满意。手术切除是目前唯一的根治性治疗方案，但患者确诊时通常已处于晚期并有远处转移，因此无法治愈。为改善患者预后，目前已采用吉西他滨和5-氟尿嘧啶等新辅助或辅助化疗，或靶向药物厄洛替尼和奥拉帕利，然而治疗结果不令人满意。据报道，由肿瘤微环境调节的成纤维细胞和免疫细胞由于其免疫抑制和治疗抵抗的特性，与PAAD的不良预后相关。然而，适应性免疫人群的研究进展令人失望，迫切需要将研究重点转向其他类型的细胞，特别是髓样细胞。褪黑素是一种调节昼夜节律的天然激素，在大脑的松果体中合成。褪黑素还参与免疫反应和抗炎作用，具有抗肿瘤特性。然而，褪黑素在介导肿瘤免疫应答中的作用尚不清楚。

技术路线：

图形摘要：

主要研究结果：

1. 褪黑素表达降低与PAAD患者不良预后相关

虽然多项体外研究揭示了褪黑素对永生化PAAD细胞系的抑制作用，但褪黑素在PAAD患者肿瘤组织中的内源性表达及其临床意义仍有待揭示。作者通过免疫组化方法检测了90例PAAD标本和邻近胰腺组织褪黑素的表达（图1A）。与配对的正常邻近组织相比，PAAD肿瘤中褪黑素的存在显著减少（图1B）。值得注意的是，胰腺组织中的褪黑素水平与PAAD患者的OS直接相关，其中这种关联在肿瘤组织中具有统计学意义，而在癌旁组织中无统计学意义（图1C、D）。

有趣的是，褪黑素水平与肿瘤进展标志物KI67和P53无关（图1E、F），这表明褪黑素的减少可能不是由高度增殖的肿瘤细胞引起的。因此，桥接褪黑素减少和不良预后的机制可能更为复杂。将患者按性别分层时，PAAD和癌旁组织中褪黑素的相对水平并没有显示出偏倚差异（图1G）。另一方面，研究报道血浆褪黑素水平随着年龄的增长而下降。它是许多衰老相关疾病的病因，包括阿尔茨海默病和帕金森病。有趣的是，作者的组织阵列染色结果显示，PAAD中的褪黑素表达与患者的年龄无关，但在胰腺的邻近组织中观察到这一关联（图1H）。提示胰腺肿瘤组织褪黑素生成减少提示PAAD患者预后不良。

图1 胰腺褪黑素水平降低与PAAD患者较短的生存期相关

2. 补充褪黑素可抑制PAAD的肿瘤进展

越来越多的证据表明，褪黑素可能抑制多种人类癌症的肿瘤进展。为了了解其在PAAD中的作用，作者首先通过胰腺注射小鼠PAAD细胞系Panc02建立了小鼠原位PAAD模型。为了确定胰腺褪黑素在PAAD进展中的作用，作者每天通过灌胃给PAAD小鼠补充饮食褪黑素。口服褪黑素治疗显著增加了PAAD小鼠胰腺中的褪黑素水平（图2A），并以剂量依赖性方式延缓肿瘤生长（图2B、C）。为了进一步测量褪黑素的抗肿瘤作用是否与PAAD中的褪黑素信号有关，在褪黑素受体拮抗剂luzindole存在的情况下给予治疗剂量的褪黑素。luzindole对褪黑素受体活性的抑制作用完全阻断了褪黑素对小鼠肿瘤进展和PAAD大小的抑制作用(图2D、E)。在使用另一鼠PAAD细胞系KPCY和人SW1990细胞系在裸鼠中的重复模型中，结果一致（图2F、G）。这些发现表明胰腺褪黑素的存在通过其信号通路限制了PAAD的肿瘤进展。

图2 胰腺褪黑素抑制PAAD的肿瘤发展

3. 褪黑素诱导胰腺中CD11bLy6G中性粒细胞样细胞的丰度

褪黑素在多种癌细胞中都有抑制癌细胞生长的报道。为了说明作者在体内观察到的褪黑素对PAAD肿瘤的抑制是否归因于其对PAAD细胞的活性的直接抑制，作者在体外用不同剂量的褪黑素培养Panc02细胞。作者确定了褪黑素治疗是否可以改变小鼠PAAD微环境的免疫特征。通过测量循环和胰腺肿瘤中的CD11bF4/80巨噬细胞、CD11bLy6G粒细胞、CD11bCD11c树突状细胞、CD3CD4辅助性T细胞、CD3CD8细胞毒性T细胞以及B220 B淋巴细胞的数量，作者发现补充褪黑素特异性地增加了胰腺肿瘤内的CD11bLy6G细胞的数量（图3A）。体内注射BrdU证实褪黑素诱导的CD11bLy6G群体在肿瘤微环境中几乎不增殖（图3B）。由于中性粒细胞和髓源性抑制细胞（MDSCs）都具有CD11b和Ly6G的细胞标记，但在肿瘤微环境中发挥不同的功能，作者进一步研究了褪黑素诱导的CD11bLy6G细胞在PAAD肿瘤微环境中的特异性表型。从褪黑素处理的PAAD中分选出CD11bLy6G细胞，he染色观察细胞形态。与骨髓来源单核细胞GM-CSF和IL-6诱导的典型MDSCs相比，褪黑素诱导的PAAD肿瘤CD11bLy6G细胞呈中性粒细胞样形态（图3C）。在分选的CD11bLy6G细胞中增加的TNFα表达也提示这个群体比MDSCs更倾向于中性粒细胞（图3D）。此外，分选的CD11bLy6G细胞不抑制CD8细胞毒性T细胞的增殖或活化T细胞标志物KI67、颗粒酶B（图3F、G）的表达。这些结果表明，补充褪黑素显著诱导PAAD肿瘤微环境中的中性粒细胞丰度。

图3 褪黑素增加体内胰腺肿瘤的中性粒细胞群

4. 褪黑素诱导的肿瘤微环境中性粒细胞参与了PAAD的肿瘤抑制作用

为了进一步确定中性粒细胞在介导褪黑素对PAAD进展的抑制作用中的作用，作者使用了一种针对Ly6G的特异性抗体来去除肿瘤微环境中的CD11bLy6G中性粒细胞。腹腔内注射抗ly6g抗体可有效减少褪黑素处理的PAAD中CD11bLy6G细胞的存在（图4）。清除CD11bLy6G中性粒细胞显著减弱褪黑素对PAAD进展的抑制作用（图4B）和实验终点的肿瘤大小（图4C）。然后，作者从接受或未接受褪黑素治疗的小鼠的PAAD肿瘤中分选了CD11bLy6G中性粒细胞。褪黑素处理的PAAD小鼠的CD11bLy6G中性粒细胞混合培养显著诱导Panc02细胞凋亡（图4D）。相反，在Transwell系统中，CD11bLy6G中性粒细胞不能诱导PAAD细胞凋亡（图4E），表明褪黑素诱导的CD11bLy6G中性粒细胞通过直接细胞-细胞接触机制发挥抗肿瘤作用。从褪黑素处理的PAAD小鼠分选出的CD11bLy6G中性粒细胞显示出比来自溶剂处理的PAAD小鼠的更高的细胞质ROS水平（图4F）。在褪黑素处理的PAAD的中性粒细胞中，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和NAPDH氧化酶2（NOX2）的表达得到了一致的诱导（图4G）。此外，正如瓜氨酸化组蛋白H3（H3Cit）和髓过氧化物酶（MPO）染色增加所示，褪黑素处理诱导了PAAD肿瘤微环境中更高水平的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）（图4H）。这些结果表明，TME中的CD11bLy6G中性粒细胞通过诱导ROS依赖的NETs发挥褪黑素在PAAD中的抗肿瘤凋亡作用。

图4 中性粒细胞通过细胞-细胞接触促进褪黑素诱导的抗肿瘤作用

5. 肿瘤细胞来源的CXCL2招募抗肿瘤中性粒细胞进入褪黑素处理的PAAD微环境

中性粒细胞在肿瘤微环境中既不是增殖性群体，也不是局部群体，主要是通过其前体在循环系统中的募集和成熟。为了确认褪黑素治疗是否与PAAD小鼠的中性粒细胞迁移和浸润相关，作者用PKH26染色分选的中性粒细胞。作者通过腹腔注射给予或不给予褪黑素干预的PAAD小鼠重新补充它们。在褪黑素处理的PAAD小鼠的肿瘤中检测到较高数量的PKH26CD11bLy6G中性粒细胞（图5A），证实褪黑素治疗诱导中性粒细胞浸润到PAAD的肿瘤微环境中。为了评估褪黑素对中性粒细胞的这种作用是否是直接的，作者将褪黑素添加到TCDS诱导的来自骨髓分离株的中性粒细胞中。作者注意到，在TCDS中补充褪黑素对诱导TCDS诱导的中性粒细胞迁移或成熟的影响很小（图5B、C）。同时，从褪黑素处理的Panc02细胞收集的上清液诱导的中性粒细胞显示出显著较高的CD11bLy6G细胞群丰度和运动能力（图5D、E）。这一观察结果表明，褪黑素不是直接调节中性粒细胞的细胞活性，而是触发肿瘤细胞获得中性粒细胞迁移和成熟所需的因子。蛋白质芯片检测上清液中肿瘤细胞来源的细胞因子和趋化因子的表达变化。与溶剂处理的肿瘤细胞相比，含褪黑素的Panc02细胞释放了不同的细胞因子和趋化因子谱（图5F）。一些趋化因子，包括CXCL2、皮肤T细胞吸引趋化因子（CTACK）和p-选择素，在褪黑素处理后表现出显著的表达变化（图5G）。CXCL2已被证明是中性粒细胞在各种生理和病理条件下的趋化剂。与正常邻近组织相比，人PAAD中的Cxcl2表达显著降低（图5H），而在褪黑素处理的小鼠胰腺中观察到Cxcl2增加（图5I）。通过流式细胞术检测MT1和MT2在不同细胞上的表达，探讨褪黑素诱导的CXCL2升高是否仅来自于肿瘤细胞。有趣的是，作者观察到，在肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞（TANs）中，褪黑素处理后MT1和MT2水平显著增加，而TANs保持不变（图5J）。为了确定CXCL2水平升高的来源，作者使用细胞内染色来确认CXCL2水平的升高主要来自肿瘤细胞，而不是TAMs，TAMs是一种释放相同细胞因子的已知免疫细胞（图5K）。此外，褪黑素处理以剂量和时间依赖性诱导CXCL2的转录和蛋白表达（图5L）。随后，作者建立了Cxcl2稳定敲低的Panc02细胞（图5M）。使用MOCK和cxcl2敲低（CXCL2KD）Panc02细胞的上清液（经过或未经过褪黑素处理）从骨髓分离出中性粒细胞。结果表明，Cxcl2敲低的褪黑素处理Panc02细胞的上清液未能诱导肿瘤细胞凋亡和引起中性粒细胞迁移（图5N、O）。这些观察表明，褪黑素诱导的PAAD细胞Cxcl2表达是抗肿瘤中性粒细胞募集到肿瘤微环境的原因。

图5 褪黑素刺激下胰腺肿瘤分泌的CXCL2可诱导中性粒细胞募集

6. 褪黑素诱导PAAD中性粒细胞的N1样抗肿瘤表型发展

有证据表明，肿瘤微环境中的中性粒细胞可能具有不同的表型，即N1样抗肿瘤表型或N2样促肿瘤表型，其特征是细胞形态和细胞代谢的差异以及一系列基因的表达。为了研究褪黑素治疗是否使中性粒细胞群体向N1样表型倾斜，作者分析了PAAD小鼠肿瘤微环境中的中性粒细胞群体。作者观察到，接受褪黑素治疗的PAAD小鼠的中性粒细胞表现出较低水平的前向散射（图6A）和较高水平的CD11b（图6B），这提示其具有抗肿瘤特性和活化表型。考虑到N1和N2表型可能在不同水平表达相似的基因谱，作者测量了几个可以代表特定表型的基因表达，并计算了N1/N2样基因表达标志物的比值。来自褪黑素处理的PAAD小鼠的分选CD11bLy6G中性粒细胞显示N1/ N2样基因表达标志物的比率增加（图6C），提示褪黑素治疗可将PAAD肿瘤微环境中的中性粒细胞极化为N1样表型。透射电子显微镜下的形态学评估显示，褪黑素处理的PAAD的中性粒细胞中有更多的空泡化结构和脱颗粒（图6D），HE染色显示褪黑素处理的PAAD的中性粒细胞中有更多的细胞质嗜天青颗粒和超分叶的细胞核（图6E、F），进一步提示N1样表型。

为了进一步研究褪黑素处理的PAAD肿瘤中性粒细胞向N1样抗肿瘤表型极化的细胞机制，作者从褪黑素处理和未处理的小鼠PAAD肿瘤中分选了CD11bLy6G中性粒细胞。作者使用非标记蛋白质组学分析来鉴定差异表达谱（图6G）。突显蛋白富集的生物学通路表明，褪黑素处理可能在PAAD肿瘤的中性粒细胞中诱导粮农组织（图6H）。增加的FAO产生细胞ROS和NETs54。为了确定褪黑素诱导的中性粒细胞的抗肿瘤活性是否依赖于脂肪酸氧化的激活，作者用FAO抑制剂etomoxir预处理褪黑素处理的PAAD中的中性粒细胞，然后与Panc02细胞共培养。etomoxir预处理显著减少了褪黑素诱导的中性粒细胞细胞内ROS的产生（图6I），并消除了其诱导Panc02细胞凋亡的活性（图6J）。这些发现表明，褪黑素诱导的细胞FAO导致了PAAD TME内中性粒细胞的N1样表型和抗肿瘤特性。

图6 中性粒细胞在褪黑素存在的情况下表现出抗肿瘤N1表型

7. 褪黑素相关NETosis提示PAAD患者预后较好

为了进一步研究褪黑素相关NETosis在PAAD中的临床意义，作者采用多重荧光染色法检测了人PAAD标本中褪黑素、CXCL2、中性粒细胞标志物MPO和NETosis标志物H3Cit的表达。与作者在实验动物模型中观察到的情况相似，较高的褪黑素水平与PAAD组织中CXCL2表达增多、中性粒细胞浸润增多和NETosis激活增加相关（图7A）。定量分析显示褪黑素水平与CXCL2的表达显著相关（图7B）和中性粒细胞浸润（图7C）。CXCL2的表达与中性粒细胞浸润呈正相关，进一步证明褪黑素诱导的中性粒细胞浸润需要CXCL2（图7D）。此外，胰腺褪黑素与MPO中性粒细胞中H3Cit的表达呈正相关，表明中性粒细胞中的NETosis激活与PAAD中的褪黑素相关（图7E）。

对PAAD患者OS进行亚组分析，也发现褪黑素生成与NETosis相关事件相关。高水平的褪黑素只能预测CXCL2相对高表达的患者更好的生存，而不能预测CXCL2相对低表达的患者（图7F）。类似地，只有当中性粒细胞MPO浸润水平相对较高时，PAAD患者的褪黑素生成与较好的生存率相关（图7G）。在CXCL2相对高表达的情况下，更多的中性粒细胞延长了患者的生存时间，中性粒细胞仅在高表达CXCL2的PAAD患者中分化生存（图7H）。这些观察表明CXCL2/中性粒细胞在褪黑素在PAAD中的肿瘤抑制作用中起重要作用。此外，在浸润到肿瘤组织的中性粒细胞中H3Cit水平相对较高的PAAD患者中，发现褪黑素水平与更好的生存相关（图7I），提示NETosis激活在介导PAAD中褪黑素的肿瘤抑制功能中潜在的重要作用。这些观察结果表明，褪黑素相关的CXCL2/中性粒细胞NETosis可能也存在于人类中，并且可以预测PAAD患者更好的生存。

图7 

结论：

该研究表明褪黑素在胰腺癌中通过促进TME中中性粒细胞的浸润和NETosis发挥抗肿瘤作用。尽管其他研究报道了NETs在肿瘤发展中的负面影响，包括组织损伤、炎症和可能的转移，但该研究证明了中性粒细胞募集到肿瘤免疫微环境中的有益作用，以及NETs对肿瘤细胞的杀伤机制。临床样本中的类似关联表明，褪黑素可能是驱动胰腺癌肿瘤抑制的免疫调节剂。

参考文献：

Chan YT, Tan HY, Lu Y, Zhang C, Cheng CS, Wu J, et al. Pancreatic melatonin enhances anti-tumor immunity in pancreatic adenocarcinoma through regulating tumor-associated neutrophils infiltration and NETosis. Acta Pharm Sin B. 2023 Apr; 13(4):1554-1567.