LncRNA BCAR4-乳腺癌迁移、侵袭和化疗耐药的靶点

乳腺癌的转移和耐药已成为成功治疗患者的障碍。lncRNAs被认为是癌症发生和发展的重要参与者。LncRNA BCAR4在乳腺癌患者组织和血浆中显著升高，并在乳腺癌细胞系中上调。BCAR4上调与TNM分期相关，手术切除乳腺肿瘤后BCAR4下调。BCAR4的沉默抑制了乳腺癌细胞的集落形成、迁移、侵袭和异种移植瘤的生长，并促进了化疗敏感性。在机制上，BCAR4通过MAPK通路的miR-644a-CCR7轴促进乳腺癌的迁移和侵袭。BCAR4通过与miR-644a结合并下调miR-644a，间接促进ABCB1表达，诱导乳腺癌化疗耐药。我们的发现为BCAR4的致癌作用提供了见解，并暗示BCAR4作为一种潜在的诊断生物标志物和一种有前途的治疗药物，可以抑制乳腺癌的转移和抑制化疗耐药。本文于2023年1月发表于“Journal of Experimental & Clinical Cancer Research”（IF=12.658）上。

技术路线

结果

1）BCAR4在乳腺癌组织和血浆样本中显著上调

我们从TCGA数据库和StarBase V3.0中检测了BCAR4在乳腺癌组织中的表达。在TCGA数据库中，BCAR4在1097个乳腺癌组织中表达高于114个非癌性乳腺组织(图1A)。在StarBase V3.0中观察到类似的结果(图1B)。接着，我们检测了80例乳腺癌患者和80例健康对照组的血浆样本中BCAR4的表达水平，发现乳腺癌血浆样本中BCAR4水平明显升高(图1C)， III期和IV期的BCAR4水平明显高于I期和II期(图1D)。此外，我们分析了20对乳腺癌患者术前和术后血浆样本。术后血浆样本中BCAR4水平显著降低(图1E)。最后，我们检测了BCAR4在不同乳腺癌细胞中的表达。BCAR4在MDA-MB-231和MCF-7中均有高表达(图1F)，因此我们选择了这两个细胞系进行后续实验。这些结果表明BCAR4在乳腺癌肿瘤和血浆样本中显著上调。

2）BCAR4的下调抑制乳腺癌的迁移、侵袭和DOX耐药

为探讨BCAR4在乳腺癌中的作用，将BCAR4 siRNA转染MCF-7和MDAMB-231细胞。RT-qPCR检测显示，BCAR4 siRNA (si-1#、si-2#和si-3#)显著抑制BCAR4的表达，其中si-2#的抑制作用最大(图2A和E)。Transwell检测显示si-2#降低了MCF-7和MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭(图2B、C、D、F、G和H)。伤口愈合实验表明，抑制BCAR4可减少乳腺癌细胞的迁移(图2I和J)。si-2#可显著减少乳腺癌细胞中的菌落数量(图2K和L)。此外，抑制BCAR4可降低MCF-7和MDA-MB-231细胞中DOX的50%抑制浓度(IC50)(图2M和N)。western blot检测显示，抑制BCAR4可下调ABCB1和两种间充质标志物(Vimentin和VEGF)的表达，并上调上皮标志物E-cadherin的表达(图2O)。综上所述，这些结果支持BCAR4的下调可抑制乳腺癌细胞的迁移、侵袭、化疗耐药、还有潜在的上皮-间质转化。

3）BCAR4下调miR-644a的表达

为了研究BCAR4促进乳腺癌进展的潜在机制，我们寻找了与BCAR4结合的miRNA。在StarBase V3.0中预测miR-644a会与BCAR4相互作用(图3A)。HEK-293T、MDA-MB-231和MCF-7中的荧光素酶报告实验显示，过表达miR-644a会抑制BCAR4野生型(WT)构建物的荧光素酶活性，但在突变型(MUT，图3B、D和F)中不会。下调miR-644a会显著增加WT BCAR4的荧光素酶活性，但在MUT中不会(图3C、E和G)。BCAR4的下调导致MCF-7和MDA-MB-231细胞中miR-644a显著上调(图3H)。此外，80例乳腺癌患者血浆样本中miR-644a水平低于健康对照组(图3I)。80例乳腺癌患者血浆中BCAR4和miR-644a的表达呈负相关(图3J)。与非癌乳腺上皮细胞系HBL-100相比，miR-644a在不同的乳腺癌细胞中也被下调(图3K)。这些结果表明BCAR4在乳腺癌中直接结合并负调控miR-644a。

4）BCAR4在乳腺癌细胞中通过miR-644a下调促进迁移、侵袭和化疗耐药性

我们用BCAR4 siRNA + miR-644a inhibitor转染MCF-7和MDA-MB-231细胞。乳腺癌细胞中，miR-644a抑制逆转了BCAR4沉默导致的集群形成减少(图4A, B)。伤口愈合和Transwell实验显示，共转染miR-644a抑制剂逆转了BCAR4 siRNA介导的MCF-7和MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭减少(图4C-4F)。此外，BCAR4沉默降低了细胞活力和DOX的IC50，这在MDA-MB-231细胞中被miR-644a抑制剂逆转(图4G)。此外，在MCF-7和MDA-MB-231细胞中，miR-644a抑制剂逆转了BCAR4抑制导致的ABCB1、Vimentin和VEGF的下调以及E-cadherin的上调(图4H)。这些结果表明，BCAR4促进乳腺癌细胞的迁移、侵袭和化疗耐药性，至少部分是通过miR-644a的下调实现的。

5）MiR-644a直接靶向CCR7，通过MAPK信号调节迁移和侵袭

我们将miR-644a模拟物和抑制剂引入MDA-MB-231细胞进行功能增益和功能损失研究。集落形成实验表明，转染miR-644a mimic的MDA-MB-231细胞形成的集落比对照细胞少。相反，转染miR-644a inhibitor的MDA-MB-231细胞的菌群数量明显高于对照细胞(图5A)。过表达miR-644a显著抑制细胞迁移和侵袭，而抑制miR-644a则促进细胞迁移和侵袭(图5B, C)。转染miR-644a mimic的MDAMB-231细胞存活率和对DOX的IC50降低，而miR-644a inhibitor则显示相反的结果(图5D)。根据TargetScan、miRTarBase和miRDB的预测，13个候选基因的3'UTR具有miR-644a结合位点(图5E)。我们专注于CCR7基因(图5E)。CCR7及其配体CCL19通过触发PI3K/AKT、MAPK、JAK/STAT3等多种信号通路，调控乳腺癌细胞EMT进程，促进肿瘤细胞的侵袭和迁移过程。在TCGA数据集中，与非癌性乳腺组织(图5F)。值得注意的是，CCR7在I期、II期和III期的表达较高(图5G)。特别是，当将乳腺肿瘤按分子亚型进行分层时，CCR7在腔内、HER2阳性、三阴性肿瘤中的表达明显高于非癌性乳腺组织(图5H)。荧光素酶报告实验结果显示，miR-644a负向调控CCR7 WT 3’UTR的荧光素酶活性，但对突变体没有影响(图5I)。相反，当miR-644a被抑制时，含有野生型3’UTR的HEK-293T细胞中荧光素酶活性明显升高(图5J)。在MDA-MB-231细胞中，过表达miR-644a显著下调ABCB1、Vimentin、VEGF、CCR7、p-ERK和p-p38，上调E-cadherin。抑制miR-644a对这些蛋白水平有相反的影响(图5K)。此外，在共转染miR-644a抑制剂的MDA-MB-231细胞中，BCAR4抑制导致的CCR7、p-ERK和p-p38的下调被逆转(图5L)。

6）下调BCAR4可减少体内肿瘤的生长和转移

为了评估BCAR4下调是否会减少体内肿瘤的生长和转移，我们将MDA-MB-231细胞注射到BALB/c裸鼠的乳腺脂肪垫中。用体内BCAR4 siRNA或对照组治疗异种移植肿瘤3周。我们发现，siBCAR4治疗小鼠的肿瘤发展比对照组慢(图6A和B)。肺和肝脏活检显示si-BCAR4小鼠的肺和肝脏转移较少(图6C和D)。此外，免疫组织化学分析表明si-BCAR4可明显提高E-cadherin的表达，抑制CCR7、VEGF和Vimentin的表达(图6E)。这些结果表明，下调BCAR4可通过提高体内CCR7的表达，显著降低乳腺癌的肿瘤生长和转移。

结论：

我们发现BCAR4通过miR-644a-CCR7轴和MAPK通路加速乳腺癌的迁移和侵袭。BCAR4还上调ABCB1以诱导乳腺癌的化疗耐药。这些发现表明BCAR4是乳腺癌转移和耐药的一个有希望的治疗靶点。

参考文献：

Wu T, Li X, Yan G, Tan Z, Zhao D, Liu S, Wang H, Xiang Y, Chen W, Lu H, Liao X, Li Y, Lu Z. LncRNA BCAR4 promotes migration, invasion, and chemo-resistance by inhibiting miR-644a in breast cancer. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Jan 10;42(1):14. doi: 10.1186/s13046-022-02588-8.