脂肪自噬在糖尿病神经性疾病中发挥关键作用

       糖尿病产生慢性炎症和脂质代谢紊乱。小胶质细胞激活引起的神经炎症和神经损伤是糖尿病相关认知障碍（DACI）的突出特征。在本研究中，作者揭示了高糖（HG）抑制脂肪自噬促进小胶质细胞内脂滴（LDs）和骨髓细胞表达的触发受体1（TREM1）积累，积累的LDs与TREM1共定位反过来加剧HG诱导的脂肪自噬损伤，随后通过NLRP3炎症小体促进HG介导的神经炎症级联反应。而LP17对TREM1的药理学阻断抑制LD和TREM1积累，减少海马神经元的炎症损伤。该研究于2023年5月发表在《Autophagy》，IF：13.3。
技术路线

1. db/db小鼠和HFD/STZ小鼠海马体小胶质细胞中LDs积累和脂肪自噬受损
       作者首先观察到LDs在大脑皮层和海马体中的积累显著增加（图1A）。用小胶质细胞标记物AIF1/IBA1、成熟星形胶质细胞标志物GFAP、神经元标记物RBFOX3/NeuN和PLIN2或BODIPY对冠状脑切片进行免疫染色。作者观察到LDs主要积累在小胶质细胞中，在星形胶质细胞和神经元中很少出现（图1A，1B）。作者之后的分析主要集中在海马体，因为它是评估认知功能的关键区域。瘦素受体缺陷（db/db）小鼠海马体中增加的PLIN2⁺ LDs与AIF1⁺小胶质细胞主要集中在CA3区域（图1A）。LDs免疫染色进一步证实增加的LDs主要分布在海马体CA3区域的小胶质细胞中（图1C）。
       透射电镜结果显示，db/db小鼠海马体中LDs增加，脂肪自噬体减少（图1D）。免疫染色结果显示，在AIF1⁺海马体小胶质细胞中，MAP1LC3B/LC3点显著减少，而SQSTM1/p62点显著富集（图1E）。

图1：低密度脂蛋白在db/db小鼠海马体小胶质细胞中积累和脂肪自噬受损

2. HG抑制脂肪自噬促进LDs在体外小胶质细胞中积累
       作者用db/m和db/db小鼠收集的血浆处理BV2细胞。在db/db小鼠高血糖血浆处理的BV2细胞中，BODIPY阳性和PLIN2阳性的LDs显著增加（图2A）。接下来，作者使用含有不同浓度葡萄糖（5.5、25和50 mM）的DMEM培养基培养BV2细胞，并通过不同的培养时间点（24、48和72 h）来探索高糖是否在LDs积累中起关键作用。结果发现，在25和50 mM葡萄糖处理的BV细胞中观察到LDs呈时间依赖性积累，并在培养72 h后达到积累峰值（图2B）。因此，在接下来的体外实验中，作者均采用25 mM葡萄糖培养72 h。作者发现db/db小鼠血浆（图2C）和25 mM葡萄糖（图2D）处理的BV2细胞中LC3B点减少和SQSTM1点增加，这暗示脂肪自噬的减少。透射电镜结果也证实HG刺激BV2细胞中LDs积累和脂肪自噬损伤（图2E）。
       然后，作者利用自噬抑制剂巴霉素A1（Baf）和活化剂雷帕霉素（RAPA）诱导BV2细胞。Baf显著诱导LC3B-II和SQSTM1表达水平，表明HG抑制脂肪自噬的开始，而不是自噬-溶酶体融合阶段（图2F）。RAPA则恢复HG受损的脂肪自噬（LC3B-II增加和SQSTM1减少）和LDs积累（PLIN2减少）（图2G），表明HG抑制脂肪自噬是LDs在BV2细胞中积累的原因。

图2：HG抑制脂肪自噬是LDs在小胶质细胞中积累的原因。

3. T2DM老年患者血浆诱导人小胶质细胞HMC3中LDs积累并抑制脂肪自噬
       接下来，作者使用T2DM（2型糖尿病）老年患者血浆和健康对照处理HMC3细胞进行体外实验。血清糖化ALB是代表过去2-4周平均血糖水平的血糖监测指标，T2DM患者的血清糖化ALB水平显著高于健康对照组（图3A）。用高血糖血浆处理后，HMC3细胞中PLIN2⁺ HMC3细胞百分比显著增加，以及SQSTM1点增加和LC3B点减少（图3B和C）。PLIN2⁺ HMC3细胞数量与DSST评分呈负相关（P=0.029）（图3D）。
       作者用5.5 mM和25 mM葡萄糖处理HMC3细胞，观察到在HG处理的细胞中，PLIN2⁺ LDs和SQSTM1点数量显著增加，而LC3B点数量减少（图3E）。此外，HG诱导PLIN2和SQSTM1表达，并抑制LC3B-II的表达（图3F）。总之，研究结果表明，HG在体外和体内均损害小胶质细胞的脂肪自噬并触发LDs积累。

图3： T2DM老年患者血浆诱导LDs在人HMC3细胞中积累并抑制亲脂性

4. HG培养和高血糖血浆培养的小胶质细胞以及db/db小鼠和HFD/STZ小鼠的海马体小胶质细胞发生TREM1积累
       小胶质细胞中TREM和TREML受体是调节炎症反应的关键受体。HG刺激后，HMC3（图4A）和BV2细胞中TREM1和TREM2 mRNA水平均显著降低。与mRNA降低水平相反，HG在HMC3细胞（图4B）和BV2细胞中显著诱导TREM1蛋白水平。接下来，作者发现db/db小鼠和db/m小鼠海马体中TREM1 mRNA表达没有显著差异，但db/db小鼠海马体中其蛋白表达明显提高（图4C）。免疫染色结果显示，在BV2细胞（图4D）和高血糖血浆处理的HMC3细胞（图4E）中，TREM1⁺细胞百分比显著增加。此外，TREM1⁺ HMC3细胞百分比与DSST评分呈负相关（P=0.00008）（图4E）。作者对T2DM点和对照小鼠脑切片进行免疫染色，发现在db/db和高脂肪饮食与STZ（HFD/STZ）小鼠海马体中，增加的TREM1与AIF1⁺小胶质细胞共染色（图4F）。

图4：高血糖血浆或HG培养的小胶质细胞和db/db小鼠海马体小胶质细胞中TREM1蛋白水平升高

5. 体内外小胶质细胞中HG诱导TREM1与LDs共定位
       用T2DM患者血浆或HG培养后，TREM1点主要富集或重叠在HMC3细胞PLIN2⁺ LDs中（图5A和B）。在高血糖血浆培养的HMC3细胞中，TREM1簇和PLIN2⁺ LDs共定位显示出不同形态。如图5C所示，TREM1位于PLIN2⁺ LDs相邻区域（顶板），或部分重叠于PLIN2⁺区域（第二面板），或完全被PLIN2⁺ LDs吞没（第三面板）。此外，正在进行融合的LDs中也观察到TREM1簇富集。db/db小鼠血浆培养的BV2细胞中也观察到这些不同形态（图5D）。在db/db和HFD/STZ小鼠海马体小胶质细胞中，还检测到TREM1与PLIN2⁺ LDs共定位（图5E）。
       接下来，作者对HMC3细胞进行co-IP，证实TREM1和PLIN2在HG环境中发生相互作用（图5F）。在HG处理的细胞中添加RAPA后，TREM1及其下游蛋白磷酸化脾脏酪氨酸激酶（SYK）表达显著下降（图5C）。这些发现表明，HG诱导TREM1与积累的LDs共定位可能有助于体内外小胶质细胞中TREM1的积累。

图5：HG在体内和体外诱导小胶质细胞中TREM1与LDs共定位。

6. HG刺激的小胶质细胞中TREM1通路抑制挽救脂肪自噬受损和LDs积累
       TREM1在自噬中起关键作用。作者探索了HG诱导TREM1共定位以及随后TREM1高水平表达是否会反过来影响小胶质细胞脂肪自噬和LDs积累（图6A）。BV2细胞中TREM1经shRNA敲除显著降低磷酸化SYK表达，如LC3B-II水平增加以及SQSTM1和PLIN2水平降低所示（图6B），HG诱导的亲脂性损伤和LDs积累减少。然后用TREM1特异性抑制肽LP17共同处理HG诱导的BV2细胞。如图6C所示，LP17给药显著减少HG诱导的SQSTM1点和PLIN2点聚集，并恢复HG在BV2细胞中诱导的磷酸化SYK、LC3B-II、SQSTM1和PLIN3表达（图6D）。在HG诱导的HMC3细胞（图6E和F）中观察到LP17类似作用，这表明抑制TREM1可以恢复HG刺激小胶质细胞中脂肪自噬损伤和LDs积累。

图6：TREM1抑制恢复HG刺激的小胶质细胞中脂肪自噬损伤和LDs积累

7. db/db模型和HFD/STZ模型中TREM1的药理学阻断改善认知功能
       接下来，作者验证TREM1在db/db模型和HFD/STZ认知障碍模型中的生物学功能。db/db和HFD/STZ小鼠腹膜内注射LP17。LP17给药2周后，通过Morris Water Maze（MWM）测试评估每只db/db小鼠的认知功能。LP17给药显著改善db/db小鼠平台穿越时间和在目标象限中花费的时间（图7A）。且注射LP17期间，平均游泳速度没有显著差异（图7B）。作者还评估了海马体神经元凋亡和突触可塑性。LP17给药显著减少db/db小鼠海马体中TUNEL⁺（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP生物素缺口末端标记）凋亡神经元数量。给予LP17显著恢复db/db小鼠海马体中下调的DLG4（突触后标志物）表达水平（图7C）。关于LP17对神经炎症的影响，在接受LP17的db/db小鼠中，促炎因子（NOS2、TNF、IL6和IL1B）产生显著降低（图7D）。最后，作者发现LP17显著减少db/db小鼠海马体CA3区域小胶质细胞中LDs积累，并促进细胞亲脂性，这与作者的体外结果一致（图7E和F）。

图7： db/db模型中TREM1经药物阻断能够改善认知功能，减少海马体神经元变性，抑制小胶质细胞炎症

结论
       HG抑制的脂肪自噬是小胶质细胞内LDs积累的原因。LDs积累与小胶质细TREM1共定位，导致小胶质细胞TREM1积累，反过来加剧HG诱导的脂肪自噬损伤，随后通过NLRP3炎症小体促进HG介导的神经炎症级联反应。此外，在db/db小鼠和HFD/STZ小鼠中，LP17可药理学阻断TREM1从而抑制LDs和TREM1的积累，减少海马体神经元炎症损伤，从而改善认知功能。

实验方法
免疫染色，透射电镜，MWM测试，TUNEL评估，细胞体外培养，RT-qPCR，Western blotting ，Co-IP，ELISA，ROS试验
参考文献
Li Q, Zhao Y, Guo H, Li Q, Yan C, Li Y, He S, Wang N, Wang Q. Impaired lipophagy induced-microglial lipid droplets accumulation contributes to the buildup of TREM1 in diabetes-associated cognitive impairment. Autophagy. 2023 May 19:1-18. doi: 10.1080/15548627.2023.2213984. Epub ahead of print. PMID: 37204119.