瘤内微生物群可以预测术后肝细胞癌的预后

       肝癌在全球最常见的癌症中排名第六，在癌症相关死亡的主要原因中排名第三。肝细胞癌（HCC）占所有原发性肝癌的80%以上。HCC肿瘤由复杂的肿瘤微环境（TME）组成，包含细胞、化学和物理成分。TME对肝细胞癌的疗效和预后具有重要意义。TME的成分被广泛认为是实体肿瘤的关键决定因素，影响实体肿瘤的发生、生长和进展。阐明TME和癌症之间的关系可以为识别新的HCC诊断标志物和开发治疗策略提供有价值的见解。最近的研究在TME中检测到微生物群的存在，肿瘤内微生物可能通过多种方式影响癌症的发生和进展。微生物群作为TME中的关键因素受到越来越多的关注。阐明微生物、TME和癌细胞之间复杂的相互作用可以为潜在的癌症治疗提供有价值的见解，并有助于在个体患者水平评估现有治疗的有效性。近年来，对肝癌肿瘤内微生物群的研究越来越多。Komiyam等利用16S rDNA测序确定了原发性和转移性肝癌组织中的微生物群特征。此外一项多组学研究发现，肿瘤内微生物群与代谢物和遗传改变密切相关。因此，进一步研究HCC肿瘤微生物群的概况，明确其临床意义和预后价值势在必行。该研究发表在《Clinical and Translational Medicine》，IF：10.6。
技术路线

图形摘要

主要研究结果
1. 人口学特征
       收集91例接受了纳入/排除程序的患者样本。中位年龄为55（35~83）岁，83例患者（91.2%）为男性。34例（37.4%）患者饮酒，73例（80.2%）患者感染HBV，15例（16.5%）患者合并2型糖尿病。62例（68.1%）患者被诊断为肝硬化；其中5例Child-Pugh分级为B级，其余57例Child-Pugh分级为a级。TNM分期I期45例（49.4%），II期19例（20.9%），III期27例（29.7%）。手术时无一例参与者发生淋巴结或远处转移。肿瘤分化程度高（30.0%）、中（48.3%）和低（20.9%）。
2. 肝细胞癌中微生物群的存在
       为了揭示HCC中微生物群的存在，作者使用EUB388探针对肿瘤样本进行了FISH。FISH信号检测证实肝细胞癌中存在细菌（图1A）。此外，微生物分布表现出一定的异质性。作者通过FISH和免疫荧光共染色进一步探索了微生物存在和免疫细胞之间的关系。CD8+细胞中存在一些FISH信号，表明CD8+细胞内存在细菌（图1B）。CD68+巨噬细胞倾向于分布在肿瘤内微生物群较丰富的区域（图1C），提示肿瘤内微生物群可能影响HCC中巨噬细胞的浸润。

图1 肝细胞癌中肿瘤内微生物群的存在及其与免疫细胞的共生关系

3. 肿瘤和邻近正常组织中的不同微生物谱
       对91例HCC患者的肿瘤和癌旁组织标本进行了检测。α多样性的Shannon指数显示肿瘤和邻近组织之间没有显著差异（p=0.436，图2A）。利用曼哈顿距离（PCoA）计算的β多样性揭示了肿瘤组和正常组之间的显著差异（p<0.001，图2B）。此外，偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）还揭示了两组之间的多样性（图2C）。平均而言，4个细菌门（变形杆菌、放线菌、厚壁菌和异常球菌-栖热菌）占据了90%的序列。这四个门在肿瘤和邻近正常组织中均占主导地位（图2D）。
       使用edgeR，在肿瘤和正常组织之间进行差异分析，以识别显著失调的扩增子序列（ASV）。分析表明，在肿瘤组织中，15个ASV上调，22个下调（图2E）。利用LEfSe方法鉴定有助于区分肿瘤和正常组织的类群。放线菌、变形杆菌、异常球菌-栖热菌和厚壁菌可能解释了两组之间的差异。作者建立了一个随机森林分类器，该分类器在区分肿瘤和邻近组织方面取得了中等性能，准确率为73.2%。属于上述四个门的属在肿瘤和邻近组织的预测中贡献最大（图2F）。
       最后，作者评估了肿瘤组和正常组分类群之间的相关性（图2G）。作者观察到两组在网络结构和复杂度上存在明显差异。在正常组中，厚壁菌、变形菌和奇球菌属的ASV之间呈显著正相关。在肿瘤组中，虽然变形杆菌和放线菌之间很少存在正相关，但肿瘤组中各菌群之间的相关性比邻近组织中的少。

图2 肝细胞癌肿瘤和邻近正常组织中微生物群的特征

4. 个体间和肿瘤内异质性
       每个个体的微生物群成被绘制在门水平。如图3A所示，HCC患者的微生物谱存在显著差异。作者还确定了每例患者多个肿瘤病变之间的微生物异质性（图3B）。值得注意的是，样本P103_tumor_2取自门静脉的一个癌栓，表明在转移过程中微生物谱发生了变化。

图3 肝细胞癌中微生物群的个体或多个肿瘤病变之间的异质性

5. 肿瘤内微生物特征和临床特征之间的相关性
       进一步分析患者的临床特征（如饮酒、肝硬化、HBV感染、肿瘤分化程度和TNM分期）与微生物谱的关系。结果显示，不同肿瘤分化程度（图4A和B）或TNM分期（图4C和D）之间的α和β多样性没有显著差异。
       进一步分析上述ASV与HCC患者生化指标的关系。放线菌与总胆汁酸（TBA）水平降低相关。变形杆菌与总蛋白（TP）、天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）和TBA水平升高相关，这可能表明肝脏的病理生理状态（图4E）。

图4 肿瘤内微生物群与临床特征的相关性

6. 肿瘤内微生物群的肝型
       具有抗肿瘤和促进肿瘤作用的微生物可能同时存在于TME中。因此，关注单一微生物会忽略TME中微生物标签的全面性。因此，为了全面了解肿瘤内微生物群和疾病结局之间的关系，作者确定了两个簇作为肿瘤内微生物谱的“肝型”。
       作者根据HCC TME中门水平微生物标签的层次聚类分析对A型和B型的标签进行了分类（图5A）。有趣的是，3例多发病灶患者的病灶被分为A型和B型，而另外5例多发病灶患者的所有病灶样本都被分为A型或B型，而不是两者都被分为A型或B型。肝B型的α-多样性显著高于肝A型（Shannon指数，p<0.001，图5B）。两个PCoA（图5C）和PLS-DA（图5D）表明两种肝型的β多样性显著不同。
       作者进一步对肝型A和肝型B的微生物群落进行了网络分析（图5E）。作者发现了两种肝型之间不同的网络模式。肝A型表现出放线菌和变形杆菌微生物之间复杂的正相关关系，形成相互作用的模式。然而，仅在乙型肝炎中发现了一些正相关，表明微生物相互作用的模式相对分散。

图5 两种肝型微生物群的聚类分析和特征

7. 肝型对肝癌预后的影响
       对于3例多发病灶被分为不同肝型的患者，这些患者被认为是A型肝型，Kaplan-Meier分析显示A型肝型预后不良（图6A和B）。A型肝型患者的中位OS为65个月，而B型肝型患者的中位OS未达到（p=0.006）。在RFS方面也获得了类似的结果，A型肝细胞癌患者的中位RFS为8个月，B型肝细胞癌患者为20个月（p=0.098）。进一步分析显示，肝型与其他临床特征（包括TNM分期、饮酒、肝硬化和HBV感染）无关（图5A），这提示肝型的微生物聚集可能是独立的预后因素。Cox回归分析用于证明肝型以及其他重要预后因素的预测能力，包括肿瘤分化程度、肿瘤大小、大血管侵犯和肿瘤数量。结果验证了肝型对OS（HR=0.296，95%CI：0.126-0.699，p=0.005）和RFS（HR=0.504，95%CI：0.276-0.918，p=0.025)的预测能力。

图6 根据肝类型定义的肝细胞癌患者的Kaplan-Meier生存曲线

结论
       该研究描述了肝癌TME中肿瘤内微生物群的特征，并发现肿瘤内微生物群的模式显著影响肝癌患者术后的生存。因此，瘤内微生物群可帮助预测患者结局，并且是每种肝型所特有的，表明预后良好的肝型可能有助于形成良好的TME和患者结局。

实验方法
16S rDNA测序，荧光原位杂交（FISH），免疫荧光
参考文献
Sun L, Ke X, Guan A, Jin B, Qu J, Wang Y, et al. Intratumoural microbiome can predict the prognosis of hepatocellular carcinoma after surgery. Clin Transl Med. 2023 Jul;13(7):e1331. doi: 10.1002/ctm2.1331.