单细胞和空间转录组分析揭示结直肠癌肝转移的细胞异质性
结直肠癌（CRC）是全球第三大最常见的恶性肿瘤，14.5 - 17.5%的患者发生肝转移。癌细胞和基质细胞之间通过分泌细胞因子、生长因子和蛋白酶来重塑肿瘤微环境（TME），从而促进转移扩散。单细胞RNA测序（scRNA-seq）描述了原发性CRC的免疫环境，但CRC肝转移的总体细胞格局以及原发性和转移性CRC之间的相互作用网络差异很少有报道。在本研究中，作者使用单细胞和空间转录组RNA测序全面绘制了CRC和匹配的CRC肝转移的细胞图谱。在CRC原发肿瘤和肝转移之间，观察到CAF、CD8+ T细胞和肿瘤相关巨噬细胞等主要细胞类型的不同表型特征和高度变化的频率，表明TME内部的分子异质性，为未来的CRC肝转移的治疗提供潜在的靶点。该研究于2023年6月发表在《Science Advances》，IF：13.6。
技术路线
主要研究结果
1. CRC原发肿瘤和CRC肝转移瘤的单细胞转录组图谱
从6例CRC患者的原发结直肠癌（CC）、邻近正常结直肠黏膜（CN）、肝转移（LM）、邻近正常肝组织（LN）和外周血（PB）收集了CD45−非免疫细胞和CD45+免疫细胞，用于单细胞转录组分析（图1A）。在主要的非免疫细胞群中，进一步的无监督聚类产生11个肿瘤细胞簇、8个成纤维细胞簇和6个内皮细胞簇（图1B）。LM中CA2和F2_MCAM富集，F4_F3和F5_CCL11在CC中显著富集（图1C）。根据已知marker的表达情况，将免疫细胞分为41个群体。虽然LN中单核细胞、NK细胞和黏膜相关不变T （MAIT）细胞占主导地位，但TIME被转移性肿瘤细胞重塑，Tregs和巨噬细胞显著上调（图1E）。这些结果表明，在CRCLM的不同组织中具有不同分布模式的多个细胞群。
图1. 结直肠癌肝转移的整体细胞景观
2. CRC原发肿瘤及CRC肝转移瘤的空间分布特征
收集6例患者的6个组织标本，包括4例结直肠癌原发灶（C1 ~ C4）和2例肝转移灶（L1和L2）。通过hematoxylin-eosin staining和每个样本的基因表达特征确定肿瘤区域（T）和癌旁区域（PT）（图2A）。与癌旁组织相比，肿瘤组织富集细胞周期相关通路，如G2-M检查点、E2F靶点和有丝分裂纺锤体（图2B）。根据基因表达谱将肿瘤组织和癌旁组织划分为不同区域（图2A）。与C1、C3、C4的瘤旁组织相比，肿瘤组织中的浆细胞比例降低（图2C、D）。
图2. 空间转录组样本的细胞鉴定
3. TME重塑骨髓细胞的组成
使用subclustering分析确定八个集群的单核细胞/巨噬细胞和三个集群的常规DCs （cDCs）（图3A）。髓样细胞在各部位有明显的分布规律（图3 B），展示出器官特异性表征。与癌旁组织相比，Mac_SPP1亚群在肿瘤组织中富集，且大部分Mac_SPP1亚群细胞来自原发肿瘤。此外，在CXCL9高表达的LM中，Mac_CXCL9的比例显著升高（图3C），提示该亚群可以募集CXCR3阳性的效应性T细胞进入肿瘤。参与募集髓系细胞（尤其是粒细胞）的基因（如CXCL3）在Mac_SPP1亚群中富集（图3D）。GSVA分析表明Mac_SPP1亚群参与炎症反应相关通路。然而，Mac_CXCL9亚群在干扰素-γ （IFN-γ）应答和T细胞活化通路中富集（图3E）。轨迹分析显示Mac_CXCL9和Mac_SPP1亚群均出现终末分化，表明它们是肿瘤激活的亚群（图3F）。
在CC和LM中均发现cDC1 （cDC_CPNE3）和cDC2 （cDC_CD1c）（图3A）。此外，cDC_LAMP3在LM中被鉴定并富集（图3C）。cDC_LAMP3高表达CCR7（图3G）， CCR7是CCL19和CCL21的受体，表明其具有向淋巴结迁移的能力。此外，cDC_LAMP3亚群高表达共刺激分子CD40、CD80和CD86，这些分子是DC成熟的标志（图3H）。在LM中cDC_LAMP3亚群的比例显著增加，表明肿瘤细胞在TIME上被驯化。
图3. 骨髓细胞的免疫景观
4. CXCL13+ T细胞在肝转移瘤中富集
CD8+ T细胞和CD4+ T细胞中都有一簇表达CXCL13, CXCR5的趋化因子（图4A、B）。与LN相比，LM中CD8_CXCL13细胞的百分比显著增加。然而，这个亚群很少在CN、LN和PB中检测到 （图4C、D）。在结肠的稳定状态下约3 - 12%的CD4细胞呈CXCL13阳性。在CC中，CD4_CXCL13的百分比减少，但与LN相比，LM中该亚群的百分比增加（图4E）。
为进一步研究CXCL13+ T细胞亚群的特征，作者分析了各亚群中上调的通路。GSVA分析显示CD8_CXCL13亚群富集T细胞增殖通路，CD4_CXCL13亚群富集G2-M检查点通路，显示出这两个亚群的增殖特性（图4F、G）。CC和LM的CD69+ CD103+ CD8+ T细胞的Ki67表达水平均高于其他CD8+ T细胞。然而，CN和LN中不同CD8+ T细胞亚群的增殖特性几乎相同（图4H）。综上所述，这些结果表明CD8_CXCL13和CD4_CXCL13细胞在结直肠癌LM中表达上调，因为它们具有较高的增殖能力。
图4. 肿瘤浸润T细胞的转录重编程。
5. CXCL13+ T细胞与结直肠癌患者的良好预后相关
在上述结果中，作者发现与CD4_CXCL13亚群相比，CD8_CXCL13在CC和LM中富集（图4D、E），表明CD8_CXCL13细胞可能是一个肿瘤激活亚群。因此，进一步研究CD8_CXCL13亚群的特征。与其他亚群相比，在CD8_CXCL13亚群中观察到高水平的耗竭标志物，如PDCD1、HAVCR2、LAG3、CTLA4和TIGIT（图5A、B）。轨迹分析显示CD8_CXCL13细胞处于终末分化状态（图5C）。此外，CD8_CXCL13亚群还表达高水平的效应分子，如GZMB（图5A、B），这表明该亚群可能保留部分抗肿瘤功能。由于在组织中很难检测到CXCL13，用CD69和CD103标记CXCL13+ 细胞，IHC结果显示CD69+ CD103 + CD8+ T细胞比其他肿瘤组织中的CD8+ T细胞更接近CK19+肿瘤细胞（图5D、E），促进其肿瘤杀伤功能。值得注意的是，CD103+ CD8+ T细胞存在于结直肠癌组织的三级淋巴结构（TLSs）中，且TLS评分越高的患者，其CD8_CXCL13评分越高，这表明该亚群可能参与TLS的形成（图5F、G）。将基因表达综合（GEO）队列中的CRC患者分为CXCL13高表达和CXCL13低表达组，发现CC中CXCL13的高表达预示着较好的总生存期（图5H）。综上所述，在TME中富集的CXCL13+ T细胞是肿瘤反应性的亚群，有助于改善CRC患者的预后。
图5. CXCL13+ T细胞的特性及预后影响
6. 结直肠癌的原发灶和肝转移灶中存在不同的成纤维细胞亚群
在结直肠癌的TME中，发现8个具有不同基因表达模式的成纤维细胞簇，分别为F1_PRELP、F2_MCAM、F3_HAS1、F4_F3、F5_CCL11、F6_IGFL2、F7_COCH和F8_MKI67 （图6A）。与CC相比，LM中F2_MCAM簇的百分比较高。F4_F3和F5_CCL11亚群主要包含来自CC的细胞（图6B）。根据批量RNA测序数据，F4_F3在CC中的浸润较CN中增加。然而，在CC中F5_CCL11亚群的百分比下降，基于轨迹分析，可能会转变为F4_F3亚群（图6C）。轨迹分析还预测F2_MCAM和F4_F3是两个不同的终末分化簇（图6C）。IHC分析证实F2_MCAM存在于CC和LM中（图6D）。然而，与单细胞分析一致，F4_F3亚群只在CC中存在，而在LM中不存在，这种现象可能是由于LN中不存在F4_F3而CN中存在（图6E、F）。ST分析也证实，CC中F4_F3亚群的浸润比LM中更多（图6G、H）。CN和CC中F4_F3亚群紧密地围绕在上皮细胞周围，促进其与上皮细胞的相互作用（图6I）。此外，F4_F3在CC中的浸润增加可能导致预后恶化（图6J）。综上所述，在结直肠癌的原发肿瘤和肝转移肿瘤中，观察到不同的表型特征和高度可变的成纤维细胞频率，这表明在不同的癌症环境中TME内的细胞异质性。
图6. 原发性和转移性肿瘤中成纤维细胞的转录组特征和异质性
7. 表达F3的成纤维细胞亚群在结直肠癌原发肿瘤中富集并分泌肿瘤因子，与结直肠癌患者的不良预后相关
进一步分析CC和LM的特征，F4_F3富集C3和CXCL1，表明该亚群参与补体和炎症反应通路（图7A、B）。F4_F3也表达高水平的MMP2和MMP3，这可能有助于细胞外基质的组织（图7A ）。此外，参与血管生成和肿瘤侵袭的肿瘤因子，如VEGFA、NRG1、HGF、GDF15、AREG和BMP2，在F4_F3中富集（图7C）。F4_F3与肿瘤细胞的相互作用分析进一步揭示它们通过NRG1和Erb-B2受体酪氨酸激酶3 （ERBB3）通路进行交叉对话，ERBB3在肿瘤细胞中富集，并能与ERBB2形成异二聚体，促进肿瘤细胞增殖和CRC患者对西妥昔单抗的耐药（图7D）。ST分析也表明F3与NRG1共定位，包围ERBB3+肿瘤细胞（图6G和图7E-I）。Transwell迁移实验显示，重组人NRG1 （rNRG1）可以促进RKO和SW620细胞的迁移（图7J）。F3和NRG1高表达的CRC患者总生存期较差（图7K）。这些结果表明，CC富集的成纤维细胞F4_F3可能通过分泌肿瘤因子导致CRC患者的不良预后。
图7. F3+成纤维细胞的特性及预后影响
8. LM TME中表达MCAM的成纤维细胞通过Notch信号通路调控CD8_CXCL13细胞的生成
Notch信号传导因子RBPJ优先表达于CD8_CXCL13和CD4_CXCL13亚群（图5A）。LM中的RBPJ表达与CXCL13和ITGAE呈正相关，而在CC中未观察到这一情况（图8A）。CD8_CXCL13和CD4_CXCL13亚群主要表达NOTCH1受体（图8B）。F2_MCAM亚群富集JAG1, F5_COCH亚群富集DLL1，而E2_DLL4子集富集DLL4、JAG1和JAG2（图8C）。使用CellPhone DB对Notch及其配体的相互作用分析显示，在内皮细胞中，E2_DLL4亚群与CXCL13+ T细胞的相互作用最强，而在成纤维细胞中，F2_MCAM亚群通过JAG1-NOTCH1与CD8_CXCL13和CD4_CXCL13亚群的相互作用最强（图8D）。
接下来，根据LM中F2_MCAM的比例将患者分为两组，发现F2_MCAM-high组患者的LM中CD8_CXCL13亚群比例更高（图8E）。GEO数据集分析显示，F2_MCAM浸润评分较高的患者在LM中有较高的CD8_CXCL13亚群浸润评分，而在CC中CD4_CXCL13亚群无此情况（图8F）。此外，通过ST检测F2_MCAM和CD8_CXCL13在LM中的位置。与单细胞结果一致，在ST样本中，F2_MCAM浸润评分较高的区域CD8_CXCL13浸润评分较高（图8G、H）。
图8. TME中NOTCH信号调节CD8_CXCL13细胞的生成
9. ST组织的细胞间相互作用网络
作者还研究了原发肿瘤和肝转移肿瘤ST中不同簇之间的细胞相互作用。结果表明，VEGFA-NRP1和VEGFA-NRP2配体-受体对在原发性和肝转移瘤中均有富集。还发现CC和LM之间存在多种不同的富集的配体-受体对。ERBB3-NRG1对在C1和C3丰富,但在L1和L2中均缺失（图9A），表明ERBB3-NRG1相互作用在原发肿瘤的发展和转移中具有潜在作用。综上所述，作者发现在结直肠癌原发肿瘤中富集的F3+成纤维细胞可以通过产生各种肿瘤因子（包括NRG1）来调节肿瘤的发展和迁移，NRG1与肿瘤细胞上表达的ERBB3相互作用来发挥其肿瘤功能。然而，与CC中的肿瘤亚群F3+成纤维细胞不同，LM中富集的MCAM+成纤维细胞可以通过Notch信号通路调节CD8_CXCL13细胞的生成，表明不同肿瘤环境中基质细胞的细胞异质性（图9B）。
图9. ST组织中细胞配体和受体的相互作用
结论
综上所述，本研究使用单细胞和空间转录组RNA测序全面绘制了结直肠癌和匹配的肝转移CRC的细胞图谱。结直肠癌原发灶和肝转移灶的不同表型和主要细胞类型，如CAF、CD8+ T细胞和肿瘤相关巨噬细胞的频率高度变化，提示TME内的分子异质性，并为未来的肿瘤治疗提供了潜在的靶点。
实验方法
单细胞RNA文库制备及测序，scRNA-seq数据质量控制与预处理，无监督细胞聚类和注释，单样品基因集富集分析，基因集变异分析，SCENIC分析，细胞分化轨迹推理，流式细胞术，分子相互作用网络分析，免疫组化染色，结直肠癌患者生存分析，基因表达相关性分析，ST组织处理、数据处理和细胞类型浸润评分计算，细胞培养，细胞迁移实验
参考文献
Wang F, Long J, Li L, Wu ZX, Da TT, Wang XQ, Huang C, Jiang YH, Yao XQ, Ma HQ, Lian ZX, Zhao ZB, Cao J. Single-cell and spatial transcriptome analysis reveals the cellular heterogeneity of liver metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 2023 Jun 16;9(24):eadf5464. doi: 10.1126/sciadv.adf5464. Epub 2023 Jun 16. PMID: 37327339; PMCID: PMC10275599.