肺泡巨噬细胞外泌体分泌的Ficolin B通过cGAS-STING信号通路通过铁死亡加剧博来霉素诱导的肺损伤
多年来，肺损伤一直危害着全球人类的健康，因此对肺损伤的发病机制进行探索和及时干预是非常必要的。Ficolin B（Fcn B）是一种可识别多种配体的识别分子，在介导细胞周期、免疫反应和肺组织稳态中发挥着重要作用。然而，Fcn B在博莱霉素（BLM）诱导的肺损伤中的作用尚不明确。本研究旨在探讨Fcn B在博莱霉素诱导的肺损伤中的来源及其机制。研究选取WT、Fcna-/-和Fcnb-/-小鼠构建BLM诱导的肺损伤模型。利用肺上皮细胞构建BLM诱导的细胞模型。临床数据表明，间质性肺病（ILD）患者血浆中的 M-ficolin（Fcn B的同源物）含量升高。在小鼠模型中，巨噬细胞衍生的Fcn B加剧了BLM诱导的肺损伤和肺纤维化。Fcn B进一步促进了自噬和铁死亡的发展。值得注意的是，细胞实验结果显示，BLM诱导的AMs外泌体转运的Fcn B通过激活cGAS-STING通路加速了肺上皮细胞的自噬和铁死亡。与此相反，3-甲基腺嘌呤（3-MA）通过抑制自噬依赖性铁死亡，逆转了BLM诱导的AMs外泌体中的Fcn B对肺上皮细胞损伤的促进作用。同时，在BLM诱导的小鼠模型中，BLM诱导的AMs外泌体分泌的Fcn B的干预作用通过铁死亡促进了肺损伤和肺纤维化。综上所述，本研究表明，由AMs外泌体转运的Fcn B通过cGAS-STING信号通路促进肺上皮细胞铁死亡，从而加剧了BLM诱导的肺损伤。本文于2023年8月发表于《cell death & disease》，IF=9。
技术路线
主要实验结果
1.巨噬细胞来源的Fcn B加重BLM诱导的肺损伤和纤维化
首先，作者的临床数据显示，间质性肺病（ILD）患者血浆中L-ficolin（Fcn A的同源物）的浓度与健康人相比无明显差异，而M-ficolin（Fcn B的同源物）的浓度则明显升高（图1A）。为了探讨Fcn B对肺损伤的影响，用BLM刺激WT、Fcna-/-和 Fcnb-/-小鼠。在BLM诱导前，WT、Fcna-/-和Fcnb-/-小鼠的存活率均为100%。然而，BLM诱导的WT小鼠的存活率明显降低，而BLM诱导的Fcnb-/-（而非 Fcna-/-）小鼠的存活率则略有降低（图1B）。HE染色证明，BLM诱导后小鼠肺泡结构受到不同程度的损伤，肺泡壁增厚并伴有炎症浸润，表明肺损伤模型构建成功。与WT+BLM 组相比，Fcnb-/-+BLM 组的肺泡结构相对完整，炎症浸润最少（图1C）。代表组织纤维化的Masson染色显示，只有Fcnb-/-+BLM组的肺间质胶原纤维沉积量少于 WT+BLM组（图1D）。同样，Fcnb-/-+BLM组BALF中的总蛋白浓度和肺组织中的羟脯氨酸浓度也明显低于WT+BLM 组（图1E、F）。此外，Fcnb-/-+BLM组肺组织中α-SMA的表达也明显低于WT+BLM组（图1E，F）。此外，与WT+BLM组相比，Fcnb-/-+BLM组小鼠肺中α-SMA的表达明显下调（图1G）。BLM诱导后，WT和Fcna-/-小鼠肺部和血液中Fcn B表达的增加主要来自巨噬细胞（部分来自中性粒细胞）（图1H，I）。与BLM诱导的WT小鼠相比，BLM诱导的Fcnb-/-小鼠肺中巨噬细胞数量明显减少。这些结果证明巨噬细胞衍生的Fcn B加重了BLM诱导的肺损伤和肺纤维化。
图1：来自巨噬细胞的Fcn B加重了BLM诱导的肺损伤和纤维化
2.Fcn B促进BLM诱导肺损伤模型中的自噬和铁死亡
接下来，为了探索Fcn B加重肺损伤的原因，作者检测了小鼠模型中与自噬和铁死亡相关的标志物水平。与WT+BLM组相比，Fcna-/-+BLM组和Fcnb-/-+BLM组的肺组织中LC3II/LC3I、Beclin1和ATG7的表达减少，而p62的表达增加（图2A）。与WT+BLM组相比，Fcnb-/-+BLM组肺和血清中MDA和Fe2+浓度降低，GSH浓度显著升高（图2B）。然后检测肺组织的ROS水平，结果显示Fcnb-/-+BLM组明显低于WT+BLM 组（图2C）。此外，与WT+BLM组相比，Fcnb-/-+BLM组肺组织中GPX4、SLC7A11、FTH1、FTL1表达明显增加，NCOA4表达减少（图2D、E）。因此，这些结果表明，在BLM诱导的肺损伤模型中，Fcn B可以促进自噬和死亡。
图2： Fcn B促进BLM诱导的肺自噬和铁死亡
3.BLM诱导的AMs外泌体加速肺上皮细胞中Fcn B的表达、自噬和铁死亡
作者应用外泌体抑制剂GW4869探讨其对AMs外泌体功能的影响。BLM诱导后，AMs中Fcn B的mRNA表达上调（图3A）。在Transwell细胞培养系统中，添加GW4869可抑制外泌体从上腔BLM诱导的AMs向下腔BLM诱导的肺上皮细胞的分泌和迁移（图3B）。当BLM处理过的肺上皮细胞与BLM处理过的AMs共同培养时，Fcn B的转录显著增加。不幸的是，使用GW4869后这一趋势被逆转（图3C）。随后，Western印迹结果显示，BLM处理过的肺上皮细胞与BLM处理过的AMs共同培养后，LC3II/LC3I、Beclin1和ATG7的表达上调，p62的表达下调。然而，添加GW4869可逆转这些变化（图3D, E）。生化检测进一步表明，与BLM处理过的AMs共同培养会显著增加BLM处理过的肺上皮细胞中MDA和Fe2+ 的浓度，同时降低GSH的浓度。然而，GW4869的存在降低了MDA和Fe2+的浓度，但增加了GSH的浓度（图3F，G）。此外，BLM处理的肺上皮细胞与BLM处理的AMs共培养后，ROS水平和死亡率也明显升高，但在GW4869条件下则有所下降（图3H，I）。同时作者发现，BLM处理的肺上皮细胞与BLM处理的AMs共同培养后，GPX4、SLC7A11、FTH1和FTL1的表达明显下调，而NCOA4的表达明显上调。然而，施用GW4869后，上述结果发生了逆转（图3J，K）。这些结果表明，AMs中Fcn B的调节可能是参与自噬和铁死亡的一种机制，从而减轻BLM诱导的肺上皮细胞损伤。
图3：BLM诱导的AMs外泌体增加Fcn B表达，促进肺上皮细胞自噬和铁死亡
4.BLM诱导的AMs通过外泌体转运的Fcn B介导肺上皮细胞自噬和铁死亡
为了研究AMs与Fcn B之间的联系，作者提取了外泌体并进行了一系列表征。NTA结果显示，大多数外泌体的大小在40到160 nm之间（图4A）。TEM图像显示，外泌体通常呈碟形，呈单一分布（图4B）。Western 印迹进一步显示，外泌体中表达了特定的标记物CD9、CD63和CD81（图4C）。PKH67标记的外泌体被肺上皮细胞成功吸收并分布在细胞核周围（图4D）。经BLM处理的肺上皮细胞与经BLM处理的AMs衍生的外泌体共培养后，Fcn B的mRNA表达上调（图4E）。BLM处理的肺上皮细胞与转染了oe-Fcnb的AMs衍生的外泌体共培养后，Fcn B的mRNA表达有更明显的增加。用si-Fcnb转染肺上皮细胞并用BLM处理后，Fcn B的mRNA表达明显受到抑制。然而，与转染了oe-Fcnb并经BLM处理的AMs衍生的外泌体共同培养可逆转这种效应（图4F）。随后的Western印迹结果显示，转染si-Fcnb可显著下调BLM处理的肺上皮细胞中LC3II/LC3I、Beclin1和ATG7的表达，并上调p62的表达。然而，与转染了oe-Fcnb和BLM处理过的AMs衍生外泌体共同培养却得到了相反的结果（图4G，H）。此外，生化检测结果表明，与转染了oe-Fcnb和BLM处理过的AMs衍生外泌体共培养后，si-Fcnb对MDA和Fe2+浓度的抑制作用以及对BLM处理过的肺上皮细胞中GSH的促进作用被逆转（图4I）。同样，与转染oe-Fcnb 和BLM处理的AMs衍生外泌体共培养后，转染si-Fcnb和BLM处理的肺上皮细胞的ROS水平和死亡率显著增加（图4J，K）。Western 印迹结果显示，在 BLM 处理的肺上皮细胞中，si-Fcnb转染可明显促进 GPX4、SLC7A11、FTH1和FTL1的表达，抑制NCOA4的表达。然而，当与转染了oe-Fcnb和BLM处理过的AMs衍生的外泌体共同培养时，这一趋势发生了逆转（图4L，M）。这些结果表明，BLM诱导的AMs 通过外泌体转运的Fcn B介导了肺上皮细胞的自噬和铁死亡。
图4：由BLM诱导的AMs转运的Fcn B外泌体有助于肺上皮细胞自噬和铁死亡
5.BLM诱导的AMs外泌体中的Fcn B通过cGAS-STING通路促进肺上皮细胞自噬和铁死亡
当用BLM诱导si-Fcnb或si-cGAS转染的肺上皮细胞时，cGAS、LC3II/LC3I、Beclin1和ATG7的表达下调，STING的磷酸化也降低，而p62的表达上调。然而，当它们与转染oe-Fcnb和BLM诱导的AMs共同培养时，cGAS、LC3II/LC3I、Beclin1和ATG7的表达上调，STING的磷酸化也增加，而p62的表达下调（图5A-C）。进一步研究发现，BLM诱导后，si-Fcnb或si-cGAS转染的肺上皮细胞中MDA和Fe2+的水平降低，而GSH的水平升高。然而，将转染oe-Fcnb的AMs与BLM诱导的AMs共同培养后，MDA和Fe2+的水平升高，而GSH的水平则相反（图5D，E）。同样，当转染了si-Fcnb或si-cGAS的肺上皮细胞被BLM诱导时，ROS水平和细胞死亡率均下降。相反，当它们与转染oe-Fcnb和BLM诱导的AMs共同培养时，ROS水平和细胞死亡率均升高（图5F，G）。铁死亡相关蛋白的检测发现，当转染si-Fcnb或si-cGAS的肺上皮细胞被BLM诱导时，GPX4、SLC7A11、FTH1和FTL1的表达上调，NCOA4的表达下调。不幸的是，当它们与转染oe-Fcnb和BLM诱导的AMs共培养时，GPX4、SLC7A11、FTH1和FTL1的表达下调，而NCOA4的表达上调（图5H，I）。这些结果表明，BLM诱导的AMs外泌体中的Fcn B促进了cGAS-STING通路介导的肺上皮细胞自噬和铁死亡。
图5：cGAS-STING通路介导的肺上皮细胞自噬和铁死亡，由BLM诱导的AMs外泌体的Fcn B促进
6.BLM诱导的AMs外泌体中的Fcn B通过cGAS-STING途径促进的肺上皮细胞铁死亡是自噬依赖性的
为进一步阐明肺上皮细胞铁死亡与自噬的关系，将si-cGAS转染和 BLM诱导的肺上皮细胞与不同AMs的外泌体共同培养，并结合自噬抑制剂3-MA进行研究。si-cGAS转染的肺上皮细胞和BLM诱导的肺上皮细胞的线粒体损伤均有所减轻。当它们与转染oe-Fcnb和BLM处理过的AMs外泌体共同培养时，线粒体损伤加剧。然而，使用3-MA逆转了oe-Fcnb转染对细胞造成的损伤，细胞中的大多数线粒体保持正常状态（图6A）。此外，3-MA还降低了BLM诱导的AMs外泌体中的Fcn B对si-cGAS转染细胞和BLM诱导的肺上皮细胞的自噬促进作用，表现出 LC3II/LC3I、Beclin1和ATG7表达减少，p62表达增加（图6B）。接着，转染oe-Fcnb和BLM处理的AMs外泌体促进了si-cGAS转染和BLM处理的肺上皮细胞中MDA和Fe2+的积累，并抑制了GSH的合成，而添加3-MA则显示出相反的效果（图6C，D）。此外，si-cGAS转染和BLM处理的肺上皮细胞与oe-Fcnb转染和BLM处理的AMs外泌体共培养后，GPX4、SLC7A11、FTH1和FTL1的表达下调，NCOA4的表达上调，但这些变化在3-MA条件下相反（图6G，H）。这些结果表明，抑制自噬可通过cGAS-STING 通路减轻BLM诱导的AMs外泌体中的Fcn B促进的肺上皮细胞铁死亡。
图6：抑制自噬可通过cGAS-STING通路减轻BLM诱导的AMs外泌体中的Fcn B 促进的肺上皮细胞铁死亡
7.在BLM诱导的小鼠模型中，从AMs外泌体转运的Fcn B通过铁死亡促进肺损伤和纤维化
为了研究AMs外泌体衍生的Fcn B在体内的功能，WT和Fcnb-/-小鼠受到BLM刺激后，尾静脉注射转染oe-Fcnb和BLM诱导的AMs外泌体进行干预。HE 染色显示，与WT+BLM组相比，Fcnb-/-+BLM组的肺泡结构更完整，炎症浸润更少。然而，与Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC组相比，Fcnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb组的肺泡结构不完整，炎症浸润增加（图7A）。Masson染色还显示，Fcnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb组的肺间质纤维化增加（图7B）。此外，我们还发现Fcnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb组比Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC组肺组织BALF总蛋白浓度增加、羟脯氨酸和α-SMA表达增加（图7C-E）。此外，与Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC 组相比，Fcnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb组肺部组织中受损线粒体数量增加（图8A）。此外，与Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC组相比，Fcnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb组肺中LC3II/LC3I、Beclin1和ATG7的表达明显上调，p62的表达明显下调（图8B）。生化检测显示，与Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC组相比，Fcnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb组肺组织和血清中MDA和Fe2+浓度显著升高，而GSH浓度降低（图8C，D）。流式细胞术显示，Fcnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb组肺组织中的ROS水平高于Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC组（图8E）。此外，与Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC组相比，Fcnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb组肺组织中GPX4、SLC7A11、FTH1和FTL1的表达显著下调，而NCOA4的表达上调（图8F，G）。此外，Fcnb-/-+BLM+Exooe-Fcnb组中cGAS的表达和STING的磷酸化明显高于Fcnb-/-+BLM+Exooe-NC组（图8H）。这些结果表明，在BLM诱导的小鼠模型中，从AMs外泌体转运的Fcn B通过铁死亡促进了肺损伤和肺纤维化。
图7：AMs外泌体转运的Fcn B有助于BLM诱导的小鼠模型的肺损伤和肺纤维化
图8：AMs外泌体转运的Fcn B促进了BLM诱导的小鼠的铁死亡
结论
总之，这是第一篇研究Fcn B在BLM诱导的肺损伤中的作用的报道，它表明由AMs外泌体转运的Fcn B可通过cGAS-STING途径促进肺上皮细胞铁凋亡，从而加重BLM诱导的肺损伤（图9）。
图9
参考文献
Wu, X., Jiang, Y., Li, R. et al. Ficolin B secreted by alveolar macrophage exosomes exacerbates bleomycin-induced lung injury via ferroptosis through the cGAS-STING signaling pathway. Cell Death Dis 14, 577 (2023). https://doi.org/10.1038/s41419-023-06104-4
常规分子实验
外泌体的提取和鉴定、HE染色、Masson染色、生化检测、蛋白质印迹检测、RT-qPCR
细胞实验
细胞培养和处理、流式细胞术
动物模型及病理实验
BLM诱导肺损伤模型的构建与干预