帕金森病还可以这样治疗？

       Prosaposin（PSAP）调节糖脂代谢，其变异与帕金森病（PD）有关。本研究中，作者发现PD患者的血浆、脑脊液（CSF）和死后大脑中PSAP水平发生变化。血浆和CSF中PSAP水平的改变与PD相关的运动损伤有关。多巴胺PSAP缺陷（cPSAP^DAT）小鼠表现出运动能力低下和抑郁/焦虑样症状，多巴胺能神经传递轻度受损，而血清素PSAP缺乏（cPSAP^SERT）小鼠表现正常。空间脂质组学显示，在cPSAP^DAT小鼠整个大脑中，高度不饱和与变短的脂质发生积累，且鞘脂减少。与WT小鼠相比，AAV引起的α-突触核蛋白过表达导致cPSAP^DAT小鼠更严重的多巴胺能衰退和更高的p-Ser129 α-突触蛋白水平。在野生型啮齿类动物中，AAV引起的PSAP过表达和包封细胞生物递送（ECB）可有效保护其免受6-OHDA和α-突触核蛋白毒性。该研究于2023年9月发表在《nature communications》，IF：16.6。
技术路线

主要研究结果
1. PD患者死后SNc 的DA神经元中PSAP减少而非PGRN
       作者在人类SNc中的酪氨酸羟化酶（TH）和神经松弛素阳性神经元中检测到高水平PSAP（图1A）。检测PD患者和对照组SNc DA神经元中PSAP和PGRN的水平，其免疫荧光染色显示PSAP和PGRN共定位（图1A）。与对照组相比，PD中单个TH阳性神经元PSAP减少，而PGRN没有变化（图1A-C）。
2. 循环PSAP与PD运动症状相关，而PGRN与非运动症状相关
       在PD患者和对照组CSF和血浆中测定循环PSAP和PGRN。CSF PSAP与血浆PSAP相关，PGRN没有发现这种相关性（图2D，E）。关于临床症状和体征，CSF和血浆PSAP均与UPDRS-III运动症状评分呈正相关（图1F，G）。然而，PSAP水平与BDI-II、MADR-S、HADS-D、HADS-A和MFS非运动症状评分无关（图1H，I）。相反，CSF和血浆PGRN与UPDRS-III评分不相关（图1J，K），但与上述非运动症状评分呈负相关（图1L，M），这些发现表明PSAP和PGRN在PD中受到了不同调节，且PSAP与PD基本运动特征有关。

图1：PD患者PSAP和PGRN受到不同调节，并与不同PD症状相关

3. 多巴胺能PSAP缺陷小鼠表现多巴胺能标记物水平降低、纹状体突触可塑性功能障碍和行为障碍，而5-羟色胺能PSAP缺乏小鼠表现正常
       为研究多巴胺能系统中的PSAP，作者产生了一种在DA神经元中具有特异性可诱导PSAP基因缺失小鼠（cPSAP^DAT）。将三苯氧胺给药5周龄小鼠，通过PSAP mRNA荧光原位杂交（FISH）分析证实整个SNc中DA神经元中PSAP缺失（图2A）。高效液相色谱法（HPLC）检测神经递质变化。16月龄cPSAP^DAT小鼠的纹状体、伏隔核和海马体中，DA、高香草酸（HVA）和3-甲氧基酪胺（3-MT）显著减少（图2B）。通过密度测定分析，作者注意到cPSAP^DAT小鼠纹状体中存在轻度和进行性TH损失（图2C，D）。为探讨PSAP在血清素神经元中的作用。作者将具有固定PSAP等位基因的纯合子小鼠与表达Cre重组酶的杂合子小鼠杂交，产生血清素神经元中PSAP基因缺失小鼠（cPSAP^SERT）。FISH证实cPSAP^SERT小鼠5-羟色胺神经元中PSAP mRNA特异性缺失（图2E）。与cPSAP^DAT小鼠相比，通过HPLC在cPSAP^SERT小鼠海马体中未检测到5-羟色胺（5-HT）和5-羟基吲哚乙酸（5-HIAA）的变化（图2F，G）。PSAP可被细胞吸收，作者在两种小鼠系中用免疫荧光染色检测PSAP蛋白。它莫西芬处理后，2月龄cPSAP^DAT小鼠DA神经元中PSAP显著减少，但随着时间的推移会发生积累（图2H，I）。PGRN遵循类似的轨迹（图2H，J）。对4月龄、8月龄和16月龄cPSAP^DAT小鼠进行行为评估（图2K）。在8月龄和16月龄cPSAP^DAT小鼠中观察到在open field test（OFT）中的Hypolocomotion（图2L）。4月龄cPSAP^DAT小鼠在pole test中（图2M）和16月龄cPSAP^DAT小鼠在beam traversal test中（图2N）发现姿势控制和精细运动损伤。cPSAP^DAT小鼠焦虑增加（图2O），由OFT中心区域时间（图2O）以及light-dark test灯箱中距离和时间测量得出（图2P，Q）。8月龄cPSAP^DAT小鼠在强迫游泳测试中也表现出抑郁状态（图2R）。相反，通过一系列行为测试评估8月龄cPSAP^SERT小鼠，没有显示异常（图2S-W）。

图2：cPSAP^DAT小鼠表现多巴胺能标志物水平降低和行为缺陷，而cPSAP^SERT小鼠表现正常

4. 空间脂质组学揭示cPSAP^DAT小鼠整个大脑中高度不饱和和缩短的脂质积累以及鞘脂减少
       考虑到皂苷在鞘糖脂（GSL）代谢中的重要作用，作者使用了高通量双极性MALDI-MSI方法。在cPSAP^DAT和对照小鼠大脑中进行非靶向空间脂蛋白分析。他们发现，4月龄、8月龄和16月龄cPSAP^DAT小鼠与其对照组之间存在显著差异，如PCA所示，如尾壳核、大脑皮层和其他几个大脑区域纹状体和SNc水平（图3A）。所有已鉴定脂质的火山图，包括甘油脂质和鞘脂，在4月龄、8月龄和16月龄cPSAP^DAT小鼠大脑区域中显示出相似的改变模式（图3B）。 进一步分析16 月龄小鼠尾壳核中的甘油酯变化（图3C）。选择心磷脂（CL）和磷脂酰胆碱（PC）进行分析。通过根据CLs的双键和链长对其进行分类，在cPSAP^DAT小鼠大脑中捕捉到两种模式：（i）高度不饱和CLs增加与低不饱和CL减少相一致，以及（ii）长链CLs减少与短链CLs增加相一致（图4D-G）。第一种模式表明脂肪酸过度去饱和，而第二种模式表明过氧化物酶体β-氧化过度活跃。cPSAP^DAT小鼠大脑中鞘脂减少（图3H）。源自神经酰胺棕榈酸前体的棕榈酰肉碱被还原（图3I）。磷酸鞘脂，神经酰胺的磷酸化衍生物，包括神经酰胺-1-磷酸（CerP）、鞘磷脂（SM）和SM的Na+/K+加合物，也被还原（图3I）。同样，GM1、GM2和GM3（图3I）通常减少。
5. 空间脂质组学揭示了cPSAP^SERT小鼠脑中缝背核神经节苷脂的有限积累和色氨酸代谢的增加
       与cPSAP^DAT小鼠相比，cPSAP^SERT小鼠表现出明显的行为异常和神经递质改变缺乏，作者检测了脂质变化是否会显示出相应的细胞类型特异性差异。作者进行非校正多重t检验，以检查DRN中的脂质变化（图3J）。与cPSAP^DAT小鼠相比，cPSAP^SERT小鼠DRN中GSL普遍增加，包括GM1，GM2和GM3（图 3K， L）。色氨酸、5-HT和5-HIAL在cPSAP^SERT小鼠中缝背核（DRN）中显著上调，表明色氨酸代谢增加（图3M，N）。

图3：cPSAP^DAT小鼠显示高度不饱和和缩短的脂质增加以及整个大脑鞘脂减少，而cPSAP^SERT小鼠表现出神经节苷脂有限积累和背侧裂核中色氨酸代谢增加

6. cPSAP^DAT小鼠对α-syn诱导的多巴胺能变性表现出更高的易感性，而病毒过表达的PSAP保护小鼠免受α-syn毒性
       4月龄cPSAP^DAT和WT对照小鼠接受带有或不带有AAV-PSAP的AAV-α-syn或AAV-GFP的单侧立体定向鼻内注射。为评估α-syn介导的DA损失引起的纹状体DA受体敏感化，在手术后6周、10周和14周进行Apomorphine旋转试验（图4A）。对侧净旋转的重复测量（RM）双向ANOVA显示，当注射AAV-α-syn但不注射AAV-GFP时，cPSAP^DAT小鼠比WT小鼠情况更加恶化（图4B）。注射AAV-PSAP补充的PSAP阻止了AAV-α-syn对cPSAP^DAT小鼠旋转行为的恶化作用（图4B）。死后小鼠大脑的免疫荧光和免疫组织化学染色证实纹状体和黑质中α-syn和GFP强烈过表达（图4C，E）。免疫荧光染色显示，AAV-α-syn降低TH阳性神经元中的PSAP（图4C，D），而AAV-GFP没有。免疫组织化学染色密度分析显示，在两种基因型中，AAV-α-syn降低同侧纹状体TH，但AAV-GFP没有降低（图4E，F）。然而，与WT小鼠相比，AAV-α-syn在cPSAP^DAT小鼠中引起更显著的纹状体和黑质TH损失（图4E，F）。此外，与行为数据一致的是，通过比较AAV-α-syn注射与AAV-β-syn+AAV-PSAP注射cPSAP^DAT小鼠，揭示了AAV-PSAP过表达使纹状体和黑质TH显著恢复（图4E，F）。DAT不仅表现出与TH相似的恢复性变化，而且在AAV-α-syn注射的WT小鼠中通过AAV-PSAP过表达而正常化（图4E，F）。磷酸化的α-syn Ser129（p-Ser129α-syn）被认为是α-syn的病理形式。为研究PSAP是否影响α-syn过表达小鼠大脑中p-Ser129α-syn水平，作者对小鼠大脑切片中的p-Ser129 a-syn进行染色。AAV-α-syn过表达导致WT小鼠中p-Ser129α-syn轻度积累，但不能被AAV-PSAP过表达逆转（图4G）。而在cPSAP^DAT小鼠大脑中，p-Ser129α-syn积累显著增加，并通过AAV-PSAP过表达逆转至与WT小鼠相似水平（图4G）。仅考虑面积大于0.64μm²的p-Ser129α-syn积累，就获得了类似结果（图4H）。        

  
图4：cPSAP^DAT小鼠更易受到AAV-α-突触核蛋白诱导的毒性，而AAV-PSAP经鼻注射可通过降低p-Ser129α-syn水平来抵消毒性

7. PSAP病毒过表达保护小鼠免受6-OHDA诱导的多巴胺能变性
       PSAP已被确定为iPSC衍生的人类神经元中氧化应激的易感基因。作者研究PSAP病毒过表达是否可以保护DA神经元免受6-OHDA诱导的氧化应激。在6-OHDA纹状体部分病变前6周，WT小鼠在同侧SNc中注射AAV-PSAP或AAV-GFP，然后在病变后两周进行Apomorphine旋转试验，以监测PSAP的保护作用（图5A）。AAV-PSAP注射小鼠向对侧旋转明显小于AAV-GFP注射小鼠，表明PSAP过表达对6-OHDA病变的纹状体多巴胺支配受到保护（图5B）。免疫荧光染色证实GFP或PSAP在小鼠中的过表达，并揭示SNc中部分保存的DA神经元（图5C）。免疫组织化学染色密度测定分析显示，在AAV-GFP注射小鼠中，6-OHDA显着降低纹状体和黑质TH和纹状体DAT免疫反应性，在AAV-PSAP注射小鼠中受到部分保护（图5D，E）。

图5：PSAP病毒过表达保护小鼠免受6-OHDA诱导的多巴胺能变性

8. ECB中的PSAP在纹状体中保护大鼠免受α-syn诱导的多巴胺能损失
       由于PSAP和PGRN是分泌蛋白，并且两者都被cPSAP^DAT小鼠DA神经元吸收，作者推断PSAP细胞外递送可能抵消α-syn诱导的毒性。ECB提供了一种有效且可逆的方法，通过移植ECB装置将治疗剂递送到脑实质目标区域。使用这种技术，作者单方面将PSAP递送到在同一半球SNc中注射AAV-α-syn的大鼠纹状体（图6A）。在同时进行脑内 AAV-α-syn 注射和纹状体 ECB 装置植入的立体定位手术后，在第 2 周、第 8 周和第 12 周的OFT中评估运动行为，然后在第 12 周进行Apomorphine旋转测试（图 6B）。在OFT中RM双向ANOVA距离分析显示，没有装置的大鼠被AAV-α-syn诱导进行性低运动，而对照ECB或ECB-PGRN大鼠在8周时表现出低运动。相反，ECB-PSAP或ECB-PSAP-PGRN大鼠表现出完整运动（图6C，D）。时间×ECB-PSAP和时间×ECB-PSAP-PGRN的显著互作表明，PSAP和PSAP-PGRN复合物补充保护大鼠免受α-syn诱导的低运动（图6C，D）。在Apomorphine旋转试验中，与未使用装置的大鼠和ECB-PGRN大鼠相比，使用ECB-PSAP的大鼠向对侧旋转明显较少，这为PSAP对α-syn诱导运动障碍的保护作用提供进一步的证据（图6E）。死后免疫组织化学染色验证纹状体和黑质中α-syn过表达（图6F）。为检测α-syn诱导对多巴胺能标志物的影响，TH，DAT和囊泡单胺转运蛋白-2（VMAT2）进行免疫组织化学染色。根据RPE细胞分泌神经营养因子和左旋多巴，对照ECB装置和其他装置显著抵消纹状体TH的损失。然而，与没有ECB的大鼠和具有对照ECB的大鼠相比，ECB-PSAP和ECB-PSAP-PGRN装置对DAT水平也显示出保护作用（图6F，G）。此外，与没有ECB的大鼠相比，具有ECB-PSAP的大鼠显示出保守的VMAT2（图6F，H）。

图6：PSAP的ECB可防止AAV-α-突触核蛋白诱导的大鼠帕金森综合征

结论
       这些实验表明，帕金森病患者PSAP水平发生改变，反映了运动症状。对DA神经元PSAP缺失的研究揭示PSAP在DA神经元生理稳态中的作用，尤其是在脂质代谢中。DA神经元中PSAP缺失增加小鼠对α-syn过表达的易感性。值得注意的是，经鼻注射AAV-PSAP可以挽救α-syn诱导的帕金森病。同样，AAV-PSAP对6-OHDA诱导的氧化应激和DA神经毒性具有保护作用。此外，纹状体ECB-PSAP植入在治疗α-syn诱导的帕金森病方面显示出治疗效果。因此，PSAP是PD发病机制的潜在调节剂，其补充可能有利于阻止PD进展。

实验方法
免疫荧光，ELISA，流式细胞术，Open field test，Light-dark transition tes，Pole test，Forced swim test，Accelerating rotarod test，Beam traversal test，Apomorphine-induced rotation，细胞培养，siRNA转染，WB，FISH，HPLC，MALDI-MSI
参考文献
He Y, Kaya I, Shariatgorji R, Lundkvist J, Wahlberg LU, Nilsson A, Mamula D, Kehr J, Zareba-Paslawska J, Biverstål H, Chergui K, Zhang X, Andren PE, Svenningsson P. Prosaposin maintains lipid homeostasis in dopamine neurons and counteracts experimental parkinsonism in rodents. Nat Commun. 2023 Sep 19;14(1):5804. doi: 10.1038/s41467-023-41539-5. PMID: 37726325; PMCID: PMC10509278.