新型TCF21high周细胞亚群通过重塑血管周围基质促进结直肠癌转移

       血源性播散是结直肠癌（CRC）转移的常见途径。然而，作为血管的守门人，肿瘤周细胞（TPCs）在血源性转移中的作用在很大程度上仍然未知。本文旨在研究TPCs的异质性及其对CRC转移的影响。通过scRNA-seq鉴定21个TPC亚群。TCF的新子集TCF21^high TPCs，称为“基质-周细胞”，与结直肠癌患者的肝转移有关。TPCs中的TCF21增加血管周围ECM硬度，胶原重排和基底膜降解，建立血管周围转移微环境，从而引发结直肠癌肝转移（CRCLM）。TPCs中的Tcf21耗竭减轻血管周围ECM重塑和CRCLM，而TCF21^high TPCs和CRC细胞的共注射显著促进CRCLM。在机制上，整合素α5的缺失抑制FAK/PI3K/AKT/DNMT1轴以损害TCF21^high TPCs中的TCF21 DNA高甲基化。本研究揭示TPC在血源性转移中以前未确定的作用，并为CRC转移提供潜在的诊断标志物和治疗靶点。本文于2023年4月发表在《Gut.》IF:24.5期刊上。

技术路线

主要实验结果

1、与结直肠癌转移相关的不同TPCs亚群的鉴定

       为剖析TPCs的异质性并评估其对CRC转移的贡献，从具有或不具有肝转移的CRC患者的原发性肿瘤组织中分离TPCs，并使用10×chromium平台通过scRNA-seq进行分析。从50000个细胞产生单细胞转录组，其在t-随机相邻嵌入（t-SNE）空间中并置以鉴定不同的簇（图1A）。TPC的基因表达谱被分类为13个不同的簇（图1B），并且使用已知的周细胞标记确定它们的起源。前10个簇特异性基因示于图1C中。簇2中的细胞比例在具有（18.5%）和不具有（3.4%）肝转移的CRC患者之间的所有亚组中显示最大差异（图1D），表明该亚组与CRCLM相关。基因本体（GO）富集分析表明，来自具有肝转移的CRC患者的样品中上调的基因与与ECM相关的几个GO术语相关（图1E），包括MATN2、CHI3L1、C0L3A1、C0L1A2、CILP、MMP2、MFAP4、FBLN1和FBLN2（图1F）。因此，将簇2中的细胞定义为基质-周细胞。选择仅在簇2中富集的基因之一MATN2作为基质周细胞的生物标志物，MATN2编码蛋白质matrilin-2（MATN2）。MATN2⁺ TPC的比率在来源于具有肝转移的CRC患者的肿瘤切片中比在没有肝转移的那些中更高（图1G）。此外，受试者工作特征（ROC）曲线分析显示，以高灵敏度和特异性预测CRCLM的MATN2⁺ TPCs的最佳截止百分比为30%（图1H）。Kaplan-Meier生存分析显示，在具有高（>30%）比例的MATN2⁺ TPCs的患者中，总生存期（OS）（图1I）和无疾病生存期（DFS）（图1J）较短。此外，MATN2⁺ TPC比值与临床病理参数的相关性分析显示，MATN2⁺ TPC比值与结直肠癌患者的TNM分期和肝转移呈正相关。总之，这些数据表明基质周细胞与CRC转移显著相关。

图1 来自CRC患者的TPC中基质周细胞的转录组学特征

2、TPCs中的TCF21与CRC转移有关

       使用单细胞调控网络推理和聚类（SCENIC）管道鉴定基质-周细胞的关键调节因子，该管道将顺式调控序列信息与scRNA-seq数据连接起来。SCENIC分析表明，TCF21的调节子活性在基质-周细胞中最高（图2A），这在所有细胞的t-SNE空间中得到证实（图2B）。此外，TCF21^high TPCs的数量与无肝转移的患者相比，在有肝转移的结直肠癌患者样本中显著增加（图2C）。此外，肝转移结直肠癌患者肿瘤切片中TCF21⁺ TPCs的比例增加（图2D）。然而，在CRC患者肝转移性肿瘤的TPCs中检测不到TCF21。Pearson相关系数分析表明TCF21⁺ TPCs与MATN2⁺基质-周细胞的比例呈正相关（r=0.805，P<0.001；图2E）。这些数据表明TCF21⁺ TPCs与基质-周细胞密切相关。ROC曲线分析显示，用于预测结直肠癌患者肝转移的TCF21⁺ TPCs最佳百分比为44%（图2F）。Kaplan-Meier生存分析表明，TCF21⁺ TPCs比率较高（>44%）的患者的OS（图2G）和DFS（图2H）明显较短。此外，TCF21⁺ TPCs比值与结直肠癌患者的TNM分期和肝转移显著相关。这些发现表明，TPCs中的TCF21可以作为CRC转移的预测生物标志物。

图2 基质周细胞中的TCF21与CRC的肝转移正相关

3、TCF21在TPCs中参与基质-周细胞表型转变和血管周围ECM的重塑

       TPCs中的TFC21上调与CRCLM呈正相关，表明TCF21可能参与TPCs的活化，并可能促进基质-周细胞的表型转变。TPCs中TCF21的耗竭或过表达对细胞增殖，粘附和迁移的影响可以忽略不计。基质-周细胞中9个基因的水平，包括IGFBP5，CILP，MFAP4，c11orf96，A2M，SFRP2，MAF，PTGDS和MATN2，相比TPC _NM ^Vector，在TPC_NM ^TCF21中显著升高（图3A）。相反，这些基因在转染siTCF21的TPC_LM（TPC_LM ^siTCF21）中的水平比那些转染阴性对照siRNA（TPC_LM ^siNC）显著降低。此外，MATN2⁺基质周细胞的百分比通过TPC_NM中TCF21的过表达而增加，并且通过TPC_LM中TCF21的敲低而降低（图3B）。

       RNA-seq和ChIP-seq结果的GO富集分析表明，TCF21调控的基因与“ECM组织”和“ECM”类别相关（图3C，D），与基质-周细胞中的表达谱相似。此外，通过ChIP-seq分析检测到的TCF21峰，通过RNA-seq检测到的TCF21诱导基因和通过scRNA-seq检测到的基质-周细胞基因的比较确定139个重叠基因（图3E）。对这些重叠基因的GO分析显示它们与“含胶原蛋白的ECM”和ECM类别相关联（图3F）。这些结果通过RT-qPCR和ChIP-qPCR得到证实，并且在TCF21过表达TPC_NM中TCF21与基质-周细胞特异性基因启动子的结合显著上调（图3G，H），通过蛋白质印迹证实（图3I）。这些结果表明，TCF21对于基质-周细胞的产生至关重要。

       ECM重塑对肿瘤转移至关重要，表现为异常的胶原蛋白产生和交联导致组织僵硬，从而促进肿瘤转移。此外，蛋白酶（如基质金属蛋白酶）对血管基底膜的降解有助于肿瘤细胞从原发性肿瘤部位逃逸。作者提出TCF21可能在血管周围ECM重塑和CRC转移中发挥作用。TCF21在TPCs中的过表达或敲低均未改变体外肿瘤细胞增殖，迁移，EMT或内皮细胞管形成。原子力显微镜（AFM）显示TPC_NM ^TCF21在诱导胶原蛋白的局部排列、卷曲和片状胶原蛋白纤维重组成放射状和成束结构以及增加粗糙度方面具有比TPC_NM ^Vector更大的能力（图3J）。此外，TPC_NM ^TCF21在硬化胶原蛋白的机械性能（图3K）和增加胶原蛋白收缩（图3L）方面优于TPC_NM ^Vector，从而增强ECM硬度。为进一步评估TCF21介导的血管周围ECM重塑对CRC细胞迀移的影响，将与TPC_NM ^Vector、TPC_NM ^TCF21、TPC_LM ^siNC或TPC_LM ^siTCF21混合的PKH- 67标记的HCT116或DLD-1细胞接种到基质胶中。TPC_NM ^TCF21在促进CRC细胞通过Matrigel包被的transwell膜侵袭方面优于TPC_NM ^Vector（图3M），而TPC_LM ^siTCF21与TPC_LM ^siNC相比，降低CRC细胞的侵袭。在器官典型培养系统上进行的实验表明，与TPC_NM ^Vector相比，当由胶原蛋白I和基质胶组成的基质与TPC_NM ^TCF21预混合时，侵入的HCT 116细胞的数量显著增加（图3N）。总的来说，这些结果表明基质-周细胞中的TCF21诱导血管周围ECM重塑并促进CRC细胞通过血管周围基质侵袭。

       作者进一步研究MATN2是否具有与TCF21相似的促转移作用。鉴于TCF21^high TPCs通过ECM重塑促进肿瘤转移，在过表达或敲低MATN2的TPC中通过RT-qPCR检查编码ECM蛋白的基因水平，例如COL1A2，COL3A1，MMP2，CHI3L1和FBLN1。结果表明，TPCs中的MATN2对这些ECM相关基因水平的影响可以忽略不计。此外，TPCs中的MATN2对肿瘤细胞侵袭的影响可以忽略不计。这些数据表明，MATN2⁺ TPCs不能为肿瘤细胞提供类似于TCF21^high TPCs的肿瘤细胞转移表型，可能仅作为基质-周细胞的特征标记物。

图3 TCF21对于基质周细胞的形成至关重要，并通过ECM重塑促进CRC细胞侵袭。

4、敲除TPCs中的Tcf21抑制CRC转移

       为确定TPCs中的TCF21是否对体内CRC转移至关重要，产生周细胞谱系追踪小鼠（PC^lin）和他莫昔芬诱导型Cspg4驱动的周细胞特异性Tcf21敲除小鼠（PC^lin-KO）（图4A）。向PC^lin和PC^lin-KO小鼠施用他莫昔芬导致用tdT荧光标记周细胞，以及PC^lin-KO小鼠中Tcf21的敲除。在体内，Tcf21的TPC特异性缺失显著抑制肝转移的形成（图4B）。与PC^lin小鼠相比，PC^lin-KO小鼠中肝转移灶的面积和数量显著减少（图4C）。此外，PC^lin-KO小鼠中EpCAM⁺ CD45⁻ CTCs的数量显著低于PC^lin小鼠（图4D）。这些数据表明TPCs中的TCF21促进CRC转移，独立于肿瘤生长和EMT。

       通过评估周细胞覆盖率和肿瘤血管中MATN2⁺基质周细胞的百分比，进一步评价TPCs中TCF21对血管结构和功能的影响。免疫荧光染色显示，TPCs中Tcf21的缺失对总周细胞覆盖率具有可忽略的影响，而MC38-luc-LM3CRCLM异种移植物的原发性肿瘤组织中MATN2⁺基质周细胞的数量在PC^lin-KO小鼠中比在PC^lin小鼠中更低（图4E）。此外，来自PC^lin小鼠的TPC中ECM重塑相关蛋白（包括MMP2、C0L1A2、C0L3A1和CHI3L1）的表达显著高于来自PC^lin-KO小鼠（图4F）。Masson染色显示，与PC^lin小鼠相比，来自PC^lin-KO小鼠的肿瘤切片中纤维状胶原组分的密度显著降低（图4G）。透射电子显微镜分析表明，在血管周围区域的胶原束在来自PC^lin-KO的肿瘤切片中比在来自PC^lin小鼠的那些中更薄（图4H）。组织硬度和肿瘤细胞的局部侵袭性需要胶原沉积，胶原取向的变化也有助于肿瘤转移。通过二次谐波产生和双光子激发荧光进一步检查血管周围胶原的结构。PC^lin-KO小鼠的血管周围胶原纤维不规则地排列在肿瘤血管周围，有卷曲的和不固定的轮廓，而PC^lin小鼠中的血管周围胶原蛋白具有几乎平行的取向，并且紧密地包围在肿瘤血管周围（图4I）。通过AFM测定血管周围区域的硬度，并用杨氏模量模式分析，并且作者发现PC^lin-KO小鼠中的血管周围区域比PC^lin小鼠中的血管周围区域显著更软（图4J、K）。由于基底膜充当肿瘤细胞内渗的物理屏障，基底膜的降解可削弱其屏障功能并增加血管通透性。结果显示，层粘连蛋白（血管基底膜中最丰富的组分）的表达在PC^lin-KO小鼠中显著高于PC^lin小鼠（图4L），并且与PC^lin小鼠相比，TPCs中Tcf21的缺失导致PC^lin-KO小鼠的血管通透性降低（图4M）。总之，基质-周细胞中的TCF21可能是血管周围ECM重塑的关键调节因子，其建立促进CRC细胞内渗的PMM。

图4 Tcf21的周细胞特异性敲除抑制血管周ECM的重塑和CRC转移

5、整合素α5缺失降低TCF21启动子甲基化并增加TCF21在TPC中的表达

       整合素，ECM组分的关键受体，作为机械换能器起作用以促进肿瘤转移。研究结果显示，在13个TPCs簇中，ITGA2、ITGA5和ITGB1在基质周细胞中显著减少（图5A）。功能获得和功能丧失实验表明，TCF21在mRNA和蛋白质水平均受到整合素α5的负调控（图5B）。

       TCF21 DNA的超甲基化抑制各种类型的肿瘤细胞中的TCF21表达，包括非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌和CRC。对TPCs中TCF21启动子内CpG岛的甲基化的评估显示，TPCs中TCF21表达与其甲基化状态负相关。此外，整合素α5正调节TCF21 DNA超甲基化，并且TPCs中整合素α5的缺失减弱TPCs中TCF21启动子的DNA超甲基化（图5C）。

       据报道，DNMT1可调节肺癌中TCF21的DNA超甲基化。研究结果表明，整合素α5的缺失通过抑制FAK/PI3K/AKT轴降低TPC_NM中DNMT1的表达，而TPC_LM中整合素α5的过表达产生相反的作用，这可以被FAK抑制剂Y15逆转（图5D）。此外，Y15或DNMT抑制剂SGI1027降低DNMT1的表达并抑制TCF21的DNA超甲基化（图5E），随后TPC_LM ^ITGA5中TCF21的表达增加（图5D）。这些结果表明，整合素α5的缺失通过抑制TCF21的DNA超甲基化来上调TPC中的TCF21。

       在原位异种移植模型中研究TPCs中整合素α5对体内CRC转移的影响，所述原位异种移植模型通过共注射HCT116-luc-LM3或DLD1-luc-LM3细胞和整合素α5-过表达或α5-敲低的TPCs产生（图5F）。与TPC_NM ^shNC相比，TPC_NM ^shITGA5增加肿瘤组织血管周围区域的胶原密度（图5G），促进血管周围基底膜降解，并显著增加肝脏中转移灶的数量和面积（图5H）。相反地，肿瘤细胞和TPC_LM ^ITGA5的共同注射显示出与使用TPC_LM^Vector的那些相比相反的效果（图5G、H）。这些数据表明，TPC中整合素α5的缺失促进CRC转移。

图5 整合素α5缺失抑制TCF21启动子的高甲基化并上调TCF21在TPC中的表达

6、TCF21^high基质周细胞与结直肠癌患者血管周围ECM重塑和肝转移相关

       为确定上述发现是否适用于CRC患者，在有和没有肝转移的CRC患者中评估血管周围胶原沉积和排列。与没有肝转移的CRC患者相比，在具有肝转移的CRC患者中，血管周围胶原蛋白丰度和血管周围胶原蛋白纤维重新定向成径向排列更显著（图6A、B）。此外，与没有肝转移的那些相比，在来自具有肝转移的CRC患者的肿瘤组织中，血管周围区域的硬度显著增强（图6C、D）。此外，在来自具有肝转移的CRC患者的TPC中，COL1A2、COL3A1和CHI3L1（图6E）以及参与基底膜降解的关键蛋白酶MMP2（图6F）的表达高于来自具有肝转移的CRC患者的TPCs。相应地，整合素α5的表达在来自具有肝转移的CRC患者的TPCs中比在没有肝转移的那些中更低（图6G）。Pearson相关分析表明，TPCs中MMP2、C0L1A2、C0L3A1和CHI3L1的水平呈正相关，而TPCs中整合素α5的水平与TCF21^high TPCs的比率呈负相关（图6E-G）。这些临床数据表明，整合素α5缺失诱导的TCF21上调是血管周围ECM重塑和PMM建立的重要调节因子，从而促进CRC转移。

图6 基质周细胞中的TCF21与源自CRC患者的原发性肿瘤中血管周围ECM的重塑相关。

       总之，本研究使用scRNA-seq揭示CRC患者中TPCs的异质性，并鉴定与CRCLM相关的TCF21^high TPCs的新亚群。这些发现揭示TCF21^high TPCs在构建PMM中的作用和机制，通过重塑血管周围ECM促进CRC转移，并提供潜在的血源性转移的诊断标志物。

实验方法

scRNA-seq，流式细胞术，血管通透性测定，染色质免疫沉淀（ChIP）和ChIP-Seq，RT-qPCR assay，细胞转染，免疫印迹实验，免疫荧光分析，H&E染色、免疫组织化学和Masson染色，RNA测序分析，迁移和侵袭测定，胶原凝胶收缩试验，细胞增殖测定，粘附试验，管形成分析，透射电镜分析，二次谐波产生和双光子激发荧光（SHG/TPEF），原子力显微镜（AFM）测量，DNA提取和亚硫酸氢盐测序

参考文献

Li X, Pan J, Liu T, et al. Novel TCF21high pericyte subpopulation promotes colorectal cancer metastasis by remodelling perivascular matrix. Gut. 2023;72（4）:710-721. doi:10.1136/gutjnl-2022-327913