癌症相关的METTL14突变诱导异常的m6A修饰，影响肿瘤生长

       甲基转移酶样3（METTL3）/METTL14的复合物主要催化m6A修饰，影响mRNA的稳定性。尽管METTL14 R298P突变在多种癌症类型中被发现，但是其生物学作用还未被完全理解。在这里，研究展示了杂合R298突变促进了癌症细胞增殖，而纯合突变减少增殖。甲基化RNA免疫沉淀测序分析表明，R298P突变减少了典型基序上的m6A修饰。而且，这种突变诱导了m6A修饰的异常基序，这只在含有纯合突变的细胞系中是最明显的。对m6A修饰位点的异常识别改变了周围典型基序的甲基化效率。一个例子是c-MET mRNA，它高度甲基化，规范基序靠近异常甲基化位点。因此，c-MET mRNA严重不稳定，降低c-Myc表达并抑制细胞增殖。这些数据表明METTL14 R298P突变影响m6A修饰的靶识别，扰乱基因表达模式和细胞生长。本研究于2023年7月发表于《Cell Rep》上，IF：8.8。

图形摘要

技术路线

主要研究内容

1、杂合子和纯合子METTL14 R298P突变对癌细胞增殖的影响相反

       为了研究癌症相关的METTL14 R298P突变如何影响m6A甲基化模式及其生物学后果，研究首先利用基于CRISPR-Cas9的同源重组建立了携带METTL14 R298P突变的子宫内膜癌细胞系（HEC108），并成功获得了在杂合状态（METTL14^+/Mu）或纯合状态（METTL14^Mu/Mu）下携带METTL14 R298P突变的多个克隆，并插入用于增加同源重组的沉默突变（SMs）（图1B和1C）。研究观察到METTL14 R298P突变不影响METTL14或Mettl3的蛋白表达（图1D）。此外，与公共数据库中METTL14在HEC108细胞中的拷贝数为2一致，研究观察到研究建立的METTL14突变的HEC108细胞系中也含有METTL14基因的两个拷贝（图1E和1F）。

       然后，研究在体外和体内评估了METTL14 R298P突变如何影响细胞增殖。与野生型（METTL14^+/+）细胞相比，携带METTL14^+/Mu突变的HEC108细胞在体外表现出更强的细胞增殖率（图2A）。相反，METTL14^Mu/Mu突变显著降低了细胞增殖率；对所有检测的克隆也观察到类似的结果。研究通过在单独含有SMs的METTL14转基因的HEC108细胞中表达METTL14蛋白来检测SMs的作用。这些分析表明，SMs不影响蛋白表达和细胞活性（图S2A和S2B），这表明细胞增殖率的差异是由杂合和纯合的R298P突变引起的，而不是SMs。为了在体内评估这种差异，研究通过裸鼠皮下注射HEC108细胞建立异种移植瘤小鼠模型。研究观察到METTL14^+/Mu细胞形成的肿瘤明显大于METTL14^+/+细胞，而携带METTL14^Mu/Mu突变的细胞形成的肿瘤明显较小（图2B和S2C）。此外，当腹腔注射到小鼠体内时，METTL14^+/Mu细胞形成的腹膜肿瘤明显更多。另一方面，METTL14^Mu/Mu细胞形成的肿瘤明显较少（图2C和S2D）。

       接下来，研究从ICGC中检索了RNA-seq结果，并确定了癌症患者中METTL14突变的合子性。研究在这些患者中没有观察到METTL14基因拷贝数的改变（图S2E）。相反，在大多数情况下，METTL14 R298P和R298H突变的等位基因频率均小于50%，这表明该突变在大多数癌症样本中为杂合突变（图2D）。这些数据表明，在杂合状态下，在癌症样本中发现的METTL14 R298P突变促进致瘤性，而在纯合状态下，它对癌症进展具有抑制作用。

图1：基因组编辑技术构建METTL14 R298P突变子宫内膜癌细胞系

图2：杂合和纯合METTL14 R298P突变对癌细胞增殖的相反作用

图S2：METTL14 R298P突变在体内确实影响肿瘤进展

2、METTL14 R298P突变减少了m6A修饰

       为了阐明METTL14^+/Mu和METTL14^Mu/Mu突变对癌细胞增殖产生相反影响的分子机制，研究比较了每种基因型中m6A修饰的数量。质谱分析显示，METTL14^+/Mu细胞中m6A修饰水平显著降低，METTL14^Mu/Mu细胞中m6A修饰水平进一步降低（图3）。研究进一步证实SMs不影响m6A修饰（图S2F）。这些结果表明METTL14 R298P突变以突变蛋白剂量依赖的方式降低m6A修饰的总水平；然而，简单的酶活性丧失或靶标识别并不一定是造成METTL14^+/Mu和METTL14^Mu/Mu细胞增殖率差异的明显原因。

图3：METTL14 R298P突变减少子宫内膜癌细胞系中m6A修饰

3、突变体METTL14（R298P）识别异常基序进行m6A修饰

       鉴于METTL14在靶标识别中发挥作用，研究接下来考察了R298P突变是否影响m6A修饰模式。研究进行了MeRIP-seq分析，通过使用抗m6A抗体进行RNA免疫沉淀，将m6A修饰位点确定为测序reads的增加高度，即一个峰值。这些分析表明，大部分靶基因在METTL14^+/+、METTL14^+/Mu和METTL14^Mu/Mu细胞中共享（图4A）。此外，三种基因型的MeRIP-seq峰均在终止密码子周围高度富集（图4B）；这种分布模式与之前的MeRIP-seq研究相似。然而，尽管[U/A/C]GGAC[U/A]（=HGGACW）序列基序对应于已知的m6A修饰位点的典型基序，但通常富集在METTL14^+/+和METTL14^+/Mu细胞来源的RNA的峰值中，研究在METTL14^Mu/Mu细胞来源的RNA的峰值中检测到了一个不同的基序，即G[G/A]A[C/U]U（=GRAYU）。在该基序中，靶向A的30位为C和U的混合物，目前尚未见报道。然而，CentriMo分析显示，该异常基序位于MeRIP-seq峰的中心区域，与METTL14^+/+和METTL14^+/Mu样品中发现的典型基序相似（图S3A-S3C），这支持了研究分析的稳健性。这些结果表明，R298P突变可能改变了METTL14的靶标识别。

       研究进一步分析了突变体METTL14识别基序，通过使用exomePeak和MetDiff分析，重点关注每个基因型之间差异甲基化的MeRIP-seq峰。exomePeak分析表明，与METTL14^Mu/Mu细胞相比，METTL14^+/+和METTL14^+/Mu细胞中甲基化程度更高的峰中显著富集了一个典型的含5’-AC-3’的基序（图S4A）。相比之下，METTL14^Mu/Mu细胞中异常的5’-AU-3’基序富集在296个峰中，与METTL14^+/+细胞相比，METTL14^Mu/Mu细胞中甲基化程度更高。在这296个峰中，有512个典型的m6A修饰位点在m6A-Atlas数据库（http://180.208.58.19/m6A-Atlas/）中注册。在这些位点中，无论METTL14基因型如何，抗m6A抗体RNA免疫共沉淀获得的平均测序reads深度均显著高于所有腺苷，这表明这些典型位点仍然可以被突变体METTL14（R298P）甲基化（图4D）。相比之下，GGAUU和GAAUU基序中腺苷的免疫沉淀测序reads的平均深度在METTL14^+/Mu样本中显著富集，而在METTL14^+/+样本中未观察到。这种富集在METTL14^Mu/Mu样本中进一步增强（图4D）。此外，MeTDiff分析检测到的差异甲基化峰比exomePeak检测到的多，在METTL14^Mu/Mu细胞中甲基化程度较低的峰中再次检测到典型的5’-AC-3’基序，而在METTL14^Mu/Mu细胞中甲基化程度较高的峰中富集了异常的5’-AU-3’基序。这些数据表明，虽然METTL14（R298P）可以在一定程度上识别典型的模体，但该突变蛋白也可以甲基化异常的5’-AU-3’模体中的腺苷。

图4：纯合子METTL14 R298P突变诱导的靶标异常识别

图S3：MeRIP-Seq峰内基序的分布

4、在METTL14^Mu/Mu细胞中，尽管m6A修饰减少，但c-Myc mRNA的表达减少

       为了鉴定受m6A修饰调控并参与细胞增殖分子通路的基因，研究利用基因集富集分析（GSEA）比较了不同METTL14基因型之间的基因表达情况。分析发现，与METTL14^+/+细胞相比，METTL14^+/Mu细胞中原癌基因c-Myc所靶向基因的表达水平显著增加（图5A）。c-Myc抑制剂以剂量依赖的方式降低HEC108细胞的活力，表明c-Myc有助于这些细胞的增殖（图5B）。已知c-Myc mRNA的表达受m6A修饰调控，研究在MeRIP-seq分析中观察到多个甲基化峰，其中包括典型位点（图5C）。为了检测HEC108细胞中c-Myc mRNA的稳定性是否受m6A修饰的调控，研究检测了加入Act.D抑制转录后c-Myc mRNA的降解率。该分析显示，METTL14^+/Mu和METTL14^Mu/Mu细胞中m6A的降解率均显著降低（图5D），表明METTL14（R298P）突变导致m6A修饰的减少稳定了c-Myc mRNA。

       然而，尽管METTL14^+/Mu细胞中c-Myc mRNA的表达显著增加，但在METTL14^Mu/Mu细胞中c-Myc mRNA的表达降低（图5E）。相应地，GSEA结果显示，与METTL14^+/+细胞相比，METTL14^Mu/Mu细胞中c-Myc靶基因的表达水平显著降低（图5F）。突变体METTL14（R298P）识别的异常基序在c-Myc mRNA中未发生甲基化（图5C）。总的来说，这些数据表明m6A修饰的减少稳定了c-Myc mRNA，这可能有助于在METTL14^+/Mu细胞中发现的细胞增殖增加，而在METTL14^Mu/Mu细胞中，c-Myc mRNA表达降低的某种机制很可能主导了m6A修饰对c-Myc mRNA的影响。

图5：Myc mRNA被METTL14 R298P突变稳定

5、异常的m6A修饰使c-MET mRNA不稳定，导致c-Myc表达减少

       为了检测异常识别基序的m6A修饰对基因表达的影响，研究比较了METTL14^+/+和METTL14^Mu/Mu细胞中含有差异甲基化峰的基因的表达水平。与METTL14^Mu/Mu细胞相比，METTL14^+/+细胞中甲基化程度更高的峰值基因显著上调（图6A）。然而，研究没有观察到与突变体METTL14（R298P）识别的异常基序富集的峰的基因有类似的差异。因此，研究进一步将METTL14^Mu/Mu细胞中甲基化水平较高的基因（285个基因）分为两个亚组，一个具有典型m6A位点（174个基因），另一个不具有典型m6A位点（111个基因），并分析了相应基因的表达情况，观察到具有典型m6A位点的基因表达水平显著降低（图6B）。这些数据表明，异常的m6A修饰可能会改变典型基序的甲基化效率，从而影响相应mRNA的稳定性。

       为了确定受异常m6A修饰影响并参与c-Myc上游信号通路的基因，研究重点关注c-MET，这是另一个受m6A修饰调控的原癌基因，已知在子宫内膜癌中发挥关键作用。作者的GSEA证明，在METTL14^Mu/Mu细胞中c-MET靶标的表达强烈下调（图7A）。相应地，METTL14^Mu/Mu中c-MET mRNA表达量显著降低，导致c-MET蛋白表达量降低（图7B、7C）。在METTL14^+/Mu细胞中未观察到这种变化。有趣的是，exomePeak分析检测到与METTL14^+/+细胞相比，METTL14^Mu/Mu在终止密码子周围甲基化程度更高的MeRIP-seq峰，其中包括4个异常基序（图7D）。

       研究测定了加入Act.D抑制转录后c-MET mRNA的降解率。该分析证明METTL14^Mu/Mu细胞中的降解率显著增加（图7E）。此外，c-MET抑制剂foretinib的加入降低了METTL14^+/+和METTL14^+/Mu细胞中c-Myc的表达和细胞活力（图7F和图7G）。综上所述，在METTL14^Mu/Mu细胞中，靠近异常m6A修饰位点的典型基序甲基化效率的增加很可能促进了c-MET mRNA的去稳定化，从而导致c-Myc的表达降低，细胞增殖受到抑制（图S6）。

图6：突变体METTL14（R298P）介导的异常m6A修饰在规范m6A位点存在时降低基因表达

图7：突变METTL14介导的异常m6A修饰破坏c-MET mRNA的稳定性

图S6：细胞增殖受m6A修饰c-MET和cMyc mRNA的调控

实验方法

表达Cas9和gRNA质粒的构建，METTL14 R298P突变敲入细胞，METTL14稳定表达细胞系的建立，Western blot，定量PCR，质谱法测定m6A含量，抗m6A抗体对m6A进行定量，体外和体内细胞增殖，细胞活力，拷贝数量变异检测，异种移植瘤小鼠模型，MeRIP-seq，GSEA，公共数据库中RNA-Seq分析，联合分析MeRIP-seq和RNA-Seq

参考文献

Miyake K, Costa Cruz PH, Nagatomo I, Kato Y, Motooka D, Satoh S, Adachi Y, Takeda Y, Kawahara Y, Kumanogoh A. A cancer-associated METTL14 mutation induces aberrant m6A modification, affecting tumor growth. Cell Rep. 2023 Jul 25;42(7):112688. doi: 10.1016/j.celrep.2023.112688. Epub 2023 Jun 23. PMID: 37355987.