生理代谢物α-酮戊二酸通过调节线粒体自噬和氧化应激来改善骨关节炎

       骨关节炎（OA）是一种与年龄相关的代谢性疾病。低度炎症和氧化应激是OA最后的常见途径。α-酮戊二酸（α-KG）是线粒体三羧酸（TCA）循环中必需的生理代谢产物，具有抗炎和抗氧化等多种功能，并且随着年龄的增长，血清水平会降低。本研究旨在探讨α-KG对骨性关节炎的治疗作用及其机制。作者首次定量检测了α-KG在IL-1β诱导的人软骨组织和骨关节炎软骨细胞中的表达水平。此外，对IL-1β诱导的骨关节炎软骨细胞用不同浓度的α-KG进行处理。分析软骨细胞的增殖和凋亡、细胞外基质的合成和降解以及炎症介质。用核糖核酸测序的方法探讨α-KG的作用机制，并进一步检测吞噬作用和氧化应激水平。这些结果在前交叉韧带切断（ACLT）诱导的年龄相关性骨关节炎大鼠模型中得到了验证。作者发现损伤的内侧软骨α-KG含量比正常外侧软骨减少了31.32%，IL-1β诱导的人骨关节炎软骨细胞比对照组减少了36.85%。α-KG可逆转IL-1β诱导的软骨细胞增殖抑制和细胞凋亡，增加ACAN和COL2A1的转录和蛋白表达，但抑制MMP13、ADAMTS5、IL-6和TNF-α的表达。在机制上，α-KG促进有丝分裂，抑制ROS的产生，这种作用可被Mdivi-1（有丝分裂抑制物）所阻断。总体而言，α-KG在人骨关节炎软骨和IL-1β诱导的骨关节炎软骨细胞中的含量减少。此外，补充α-KG可通过调节线粒体自噬和氧化应激来减轻骨关节炎的表型，提示其有可能成为改善骨关节炎的治疗靶点。本文于2023年6月发表于期刊《Redox Biology》，IF=11.4

主要技术路线

主要研究结果

1、人骨关节炎软骨中α-KG含量及IL-1β对软骨细胞增殖和凋亡的影响

       α-KG是戊二酸的酮基衍生物之一（图1A），戊二酸来自异柠檬酸，在生理上产生丁二酰辅酶A（图1B）。因此，作者首先检测了α-KG在IL-1β诱导的人软骨组织和软骨细胞中的含量（图1C）。结果表明，损伤内侧软骨α-KG含量较正常外侧软骨降低31.32%（P<0.0821，图1D），人软骨细胞经IL-1β处理24 h后含量下降36.85%，但差异无统计学意义（P=0.0821，图1E）。然后，检测α-KG对原代人软骨细胞的影响。CCK-8实验显示，当α-KG浓度小于2 mM或作用时间小于72h时，对软骨细胞活力无明显影响（P<0.05，图1F，G）。因此，作者观察了2 mM α-KG作用24 h对IL-1β诱导的人软骨细胞增殖和凋亡的影响。EDU结果显示，IL-1β可抑制原代培养的人软骨细胞的增殖，而α-KG可逆转这一作用（图1H和I）。流式细胞仪检测显示，IL-1β可促进原代培养的人软骨细胞的凋亡，α-KG也可在一定程度上减轻这一作用（图1J和K）。

图1 α-KG含量及其对IL-1β诱导的软骨细胞增殖和凋亡的影响

2、α-KG对IL-1β诱导的软骨细胞骨性关节炎表型的影响

       除软骨细胞外，细胞外基质（ECM）是软骨组织的另一个主要成分。因此，采用RT-qPCR方法检测基质合成相关基因（ACAN和COL2A1）和降解相关基因（MMP13和ADAMTS5）在转录水平的表达。结果表明，α-KG以浓度依赖的方式促进IL-1β诱导的骨关节软骨细胞ACAN和COL2A1 mRNA的表达，抑制MMP13和ADAMTS5的表达（P<0.05，P<0.01，图2A-D）。IF染色和免疫印迹结果显示，α-KG以浓度依赖的方式促进IL-1β诱导的人软骨细胞COL2A1蛋白表达，抑制MMP13蛋白表达（P<0.01，图2E-G）。进一步检测α-KG对炎症介质的影响。RT-qPCR法和Western印迹结果显示，IL-1β可浓度依赖性地上调人软骨细胞IL-6和TNF-α的转录和蛋白表达水平，而α-KG则以浓度依赖的方式降低IL-6和TNF-α的转录和蛋白表达水平（P<0.05，P<0.01，图2G-I）。

图2 α-KG对IL-1β诱导的人软骨细胞基质合成、降解及炎症反应的影响

3、α-KG对骨关节炎软骨细胞线粒体自噬和ROS生成的影响

       为了探讨α-KG减轻骨性关节炎表型的机制，对其进行了测序。测序结果表明，与对照组相比，IL-1β处理组降低了与基质合成相关的基因（ACAN和COL2A1）的转录表达，上调了与基质降解（如MMP3、MMP9、MMP10、MMP13、ADAMTS1、ADAMTSL1、ADAMTS5、ADAMTS7和ADAMTS8）和炎症介质相关基因（如IL-1α、IL-1R、IL-6、IL-6R、NFKBIA、TNFRSF9和TNFRSF15）的表达（图3A）。然而，与单独处理IL-1β相比，α-KG与IL-1β联合作用上调了与基质合成相关的基因（COL2A1），下调了与基质降解（如MMP9、MMP13、ADAMTS1、ADAMTSL2、ADAMTS5、ADAMTS6、ADAMTS9和ADAMTS12）和炎症介质（IL-6ST、IL-6R、NFKBIA、TNFSF8和TNFSF15）相关基因的表达（图3B）。有趣的是，与线粒体自噬相关的基因表达的变化与与基质合成、降解和炎症介质相关的基因的表达一致。IL-1β降低PINK1、ATG4D和JUN的转录表达，而α-KG增加PINK1、PARKIN、ATG4D、JUN、TOMM7和DAPK2的表达（图3A和B）。KEGG分析还显示了与炎症、增殖、凋亡、氧化磷酸化和有丝分裂相关的通路的变化（图3C）。

       因此，进一步用透射电子显微镜检测有丝分裂吞噬作用。结果显示，IL-1β诱导的软骨细胞线粒体形态正常、规则、完整，但肿胀、空泡化、密度降低、结构不完整。α-KG的加入改善了线粒体结构，促进了线粒体自噬，从而增加了IL-1β诱导的软骨细胞中受损线粒体的清除（图3D）。免疫荧光共定位显示α-KG增加了IL-1β诱导的人软骨细胞中线粒体和溶酶体的相互作用（P<0.05，P<0.01，图3E）。Bafilomycin A1，可以通过抑制溶酶体酸化阻止晚期自噬通量，被进一步测定自噬通量。结果显示，α-KG显著增加IL-1β诱导的骨关节炎软骨细胞的自噬通量（P<0.01）。RT-qPCR和western blot也证实α-KG上调了线粒体自噬标志物（PINK1和Parkin）相关基因的表达（P < 0.05, P < 0.01，图4A, B）。最后，检测线粒体功能。结果表明，α-KG处理显著提高了IL-1β诱导的软骨细胞基础呼吸、最大呼吸、ATP相关的线粒体呼吸和备用呼吸能力（P < 0.05, P < 0.01）。同时，α-KG也能降低IL-1β诱导的人软骨细胞中ROS的生成（P < 0.05, P < 0.01，图4C）。提示α-KG增加骨关节炎软骨细胞的线粒体自噬，改善线粒体功能，抑制ROS生成。

图3 α-KG对IL-1β诱导的人软骨细胞线粒体自噬的影响

4、Mdivi-1对软骨细胞α-KG活性的影响

       已经证实Mdivi-1是一种线粒体自噬抑制剂。为了进一步探讨线粒体自噬在介导α-KG对IL-1β诱导的人软骨细胞骨关节炎表型的缓解作用中的作用，作者采用Mdivi-1联合α-KG治疗IL-1β诱导的软骨细胞。TEM和IF结果显示，α-KG和Mdivi-1抑制了线粒体和溶酶体共定位，改善了线粒体形态，增加了ROS的产生（P < 0.05, P < 0.01，图3D和E，4C）。α-KG与Mdivi-1联用也降低了PINK1和Parkin的转录组和蛋白表达（P < 0.05, P < 0.01，图4A，B），这些结果表明Mdivi-1逆转了α-KG对线粒体自噬的影响。

       用EdU和流式细胞术检测软骨细胞的增殖和凋亡情况，发现Mdivi-1可以抵消α-KG促进增殖和抑制细胞凋亡的作用（且有增强的趋势）（P = 0.0564, P < 0.01，图1H-K）。补充α-KG后，藏红花O染色增强，但可被MDVI-1抑制（P<0.01，图4D）。RT-qPCR结果显示，Mdivi-1逆转了α-KG诱导的人软骨细胞基质合成相关基因（ACAN和COL2A1）转录表达增加（P<0.05，P<0.01，图4E和F），基质降解相关基因（MMP13和ADAMTS5） （P<0.05，P<0.01，图4G），以及炎性介质（IL-6和TNF-β）表达降低（P<0.01，图4H和I）。Western印迹和进一步证实Mdivi-1可抑制COL2A1蛋白表达的增加和MMP13、IL-6和TNF-α的表达降低（P=0.0559，P<0.05，P<0.01，图4J）。

图4 Mdvi-1对人软骨细胞α-KG活性的影响

5、补充α-KG对大鼠骨性关节炎表型的影响

       为进一步评价α-KG的作用，采用ACLT建立大鼠骨性关节炎模型。番红O-固色绿染色显示，α-KG修复后，ACLT可引起软骨脱落、潮标中断或消失、软骨纤颤、软骨裂隙和侵蚀、软骨变薄和OARSI评分增加（P<0.01），这些可由α-KG恢复（P < 0.01，图5A和B）。RT-qPCR显示，与对照组相比，ACLT可下调软骨基质合成相关基因（ACAN和COL2A1）的表达水平，上调与基质降解相关的基因（MMP13和ADAMTS5）和炎症介质（IL-6和TNF-α）的基因表达水平，而ACLT+α-KG组则相反（P<0.05，P<0.01，图5C-H）。免疫组化进一步证明，α-KG逆转了ACLT诱导的COL2A1蛋白表达下降和MMP13水平升高（P<0.01，图5I，J）。

图5 补充α-KG对大鼠骨性关节炎模型的影响

6、补充α-KG对软骨组织线粒体自噬的影响

       最后，对软骨组织进行线粒体自噬实验。透射电子显微镜显示，ACLT+α-KG组线粒体肿胀、空泡化、结构不完整，线粒体形态正常、规则、完整（图6A）。RT-qPCR和IHC证实人骨关节炎软骨组织中PINK1和Parkin的转录表达和Parkin的蛋白水平降低（P<0.05，P<0.01，图6B，C）。在ACLT诱导的大鼠骨性关节炎软骨组织中，PINK1和Parkin的转录和蛋白表达也持续下降（P<0.05，P<0.01，图6D-G）。然而，α-KG可逆转上述作用（P<0.05，P<0.01，图6D-G）。上述结果表明，α-KG可降低骨关节炎大鼠软骨组织的线粒体自噬水平，并促进其软骨组织的线粒体自噬作用。

图6 补充或不补充α-KG的人OA软骨和ACLT诱导的大鼠OA模型中线粒体自噬的变化

       总体而言，这项研究证实，在人OA软骨和IL-1β诱导的骨关节炎软骨细胞中，α-KG（线粒体TCA循环的一种生理代谢产物）的含量降低。此外，补充α-KG可以促进软骨细胞增殖和凋亡抑制，逆转体内外细胞外基质合成减少和降解增加以及炎症反应，减少氧化应激。这是由α-KG促进软骨细胞和软骨组织线粒体自噬的能力介导的。此外，线粒体自噬抑制剂Mdivi-1可以抑制α-KG的作用。简而言之，作者的研究结果提供了迄今为止未记录的α-KG在维持软骨稳态中的作用证据，表明它可以成为OA的潜在治疗靶点和药物。

实验方法

CCK-8、EdU检测、流式细胞术、蛋白质印迹、RT-qPCR、免疫组化、RNA测序、大鼠实验

参考文献

L. Liu, W. Zhang, T. Liu, Y. Tan, C. Chen, J. Zhao, H. Geng, C. Ma, The physiological metabolite α-ketoglutarate ameliorates osteoarthritis by regulating mitophagy and oxidative stress, Redox Biology 62 （2023）.