急性髓系白血病治疗：依美司他诱导铁死亡发生

简介

       急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia，AML）是一种罕见的侵袭血液及骨髓的肿瘤，是白血病家族中成年人最常见的类型之一，它进展快速，极具侵袭性。患者的5年总生存率不到45%，主要是由于化疗或靶向治疗后的疾病复发。端粒酶在大多数癌症包括AML中高度表达和重新激活，因此它可作为一种治疗靶点。伊美司他作为端粒酶抑制剂已被验证在血液系统髓系恶性肿瘤中具有临床疗效，但机制尚不明确。本研究中作者证明了伊美司他促进含有多不饱和脂肪酸的磷脂的形成，导致脂质过氧化和氧化应激水平过高；伊美司他的疗效在ROS清除后降低。作者计划利用这些机制开发一种优化的治疗策略，使用氧化应激诱导化疗来提高患者样本对伊美司他的敏感性，从而在AML中实现疾病控制。该研究于2023年10月30日发表在《Nature Cancer》，IF：22.7

技术路线

主要研究结果

1. 建立AML患者来源的人源性组织异种移植（PDX）模型

       成功移植到NSGS中的AML患者样本随机选择30例，根据患者年龄、性别、ELN2017预后风险、WHO疾病分类等临床参数进行表征（图1a-c），发现17个样本来自女性AML患者（图1b），OncoPrint图表明NPM1、DNMT3A、ARID1B和FLT3等基因中经常检测到致癌突变（图1c）。总之，作者成功建立了AML患者来源的PDX模型。

图1： AML患者样本的综合分析

2. AML PDX中伊美司他的II期临床前试验

       为了验证伊美司他在AML中的临床前疗效，将30个AML患者样本分别移植到12个NSGS受体（n=360个PDX）中。出现AML负荷后，将PDX随机分为伊美司他治疗组和载体（PBS）对照治疗组，治疗至少持续30天。与对照组相比，伊美司他治疗的中位生存期显著延长（图2a），外周血供体嵌合、骨髓细胞和供体嵌合、AML患者衍生细胞数量以及脾脏供体嵌合显著减少（图2b-g）。作者还评估了与白血病起始活性相关的AML表面标记物的变化（图2h）。脾脏AML细胞群中富集的CD34⁺CD38^-白血病干细胞在伊美司他治疗后显著降低（图2i）。

       接下来作者评估了PDX中伊美司他治疗的转录结果，与对照组相比，伊美司他治疗的AML供体细胞显著富集了功能注释为干扰素信号、细胞周期、TP53转录调节和MAPK信号的基因（图2j，k）；同时，AML供体细胞中TERT mRNA在治疗后呈现下降趋势（图2l）），但端粒长度无明显变化（图2m，n）。

图2： 伊美司他在AML PDX的随机II期临床前试验中的疗效

3. CRISPR/Cas9筛选识别伊美司他的关键效应物

       作者使用人类全基因组敲除文库（Brunello文库）进行阳性筛选以鉴定对伊美司他产生耐药性的基因，联合RIGER和STARS算法确定了七个功能基因：脂肪酸去饱和酶2（FADS2）、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）、线粒体内膜转位酶17A（TIMM17A）、晚期内体/溶酶体衔接子、MAPK和MTOR激活剂1-3（LAMTOR1、LAMTOR2、LAMTOR3）和肌球蛋白调节轻链相互作用蛋白（MYLIP）（图3a）；它们在调节脂质代谢、铁离子结合、线粒体基质和溶酶体生物发生和定位等功能上具有密切关系（图3b）。作者随后进行了竞争实验，确定FADS2或ACSL4功能丧失会导致伊美司他治疗的AML细胞具有竞争生长优势（图3c-f）。当使用CD33（预测对细胞功能有中性影响）敲除或空载对照时，伊美司他治疗后未观察到竞争生长（图3c-f）。上述结果表明ACSL4和FADS2是伊美司他在AML治疗中的关键效应物。

图3： 利用全基因组CRISPR/Cas9缺失鉴定伊美司他疗效的关键介质

4. 伊美司他是铁死亡的诱导剂

       多不饱和脂肪酸（PUFA）磷脂合成的关键酶受到ACSL4和FADS2的编码调节。作者发现在NB4细胞中，伊美司他治疗后PUFA磷脂显著富集，FADS2缺失则减少了这种脂质的富集（图4a）。这表明伊美司他以FADS2依赖性的方式诱导PUFA磷脂合成。

       ACSL4被认为是铁死亡的关键调节因子。铁死亡的标志之一是脂质过氧化，因此ACSL4与脂质过氧化密切相关。为了验证伊美司他与脂质过氧化的关系，作者用C11-BODIPY（脂质过氧化荧光探针）处理AML细胞，图5b可以看出伊美司他治疗后荧光强度显著增加，这表明伊美司他在体外诱导AML细胞发生脂质过氧化。接下来作者评估了活性氧（ROS）是否也受到伊美司他影响，结果发现，与对照组相比，伊美司他治疗后ROS显著增加，当加入活性氧清除剂Ferrostatin-1后，增加变少了，这表明伊美司他促进AML细胞中的ROS生成（图5a）。在ACSL4或FADS2功能缺失的AML细胞中，脂质过氧化和ROS生成明显降低，表明伊美司他诱导的脂质过氧化和ROS产生依赖于体外功能性FADS2和ACSL4（图4b，c）。AML PDX模型中体内验证了伊美司他诱导的脂质过氧化与ACSL4表达增加有关（图5c）；liproxstatin处理不仅抑制伊美司他诱导的脂质过氧化和ROS生成（图5d，e），而且降低了伊美司他的疗效（图5f）。

       以上数据表明伊美司他通过ACSL4和FADS2介导的PUFA代谢、过度脂质过氧化和氧化应激改变诱导细胞铁死亡发生。

图4： 伊美司他是铁死亡的有效诱导剂

图5： ROS清除降低伊美司他疗效

5. 脂代谢先于伊美司他诱导的铁死亡

       通过转录组学和功能遗传学综合研究伊美司他诱导铁死亡的机制。作者在Brunello文库和AML PDX RNA-seq数据集中取交集，确定了11个伊美司他靶点候选物（图6a），其中两种VIM（波形蛋白）和LMNA（核纤层蛋白A/C），是共调节模块的一部分（图6a），最近被鉴定为端粒G-四链体结合蛋白。VIM除了结合端粒G-四链体外，还是脂滴生物发生和稳定性的结构成分。

       作者假设伊美司他诱导的PUFA磷脂合成、氧化应激和铁死亡由脂噬引起。AML细胞中VIM高度表达（图6b），VIM功能缺失导致细胞在伊美司他治疗后具有竞争生长优势（图6c）。利用C12-BODIPY（一种脂滴的荧光脂肪酸探针）和LAMP1（晚期内体标记物）评估脂噬，发现脂滴与内体的共定位显著增加，表明脂噬增加（图6d）。通过氯喹抑制脂噬后伊美司他诱导的细胞死亡也随之减少（图6e）。

       上述结果证明了AML中伊美司他的作用机制：通过调控端粒G-四链体结合蛋白干扰脂滴结构成分导致脂滴稳态受损，发生脂噬，最终诱导铁死亡发生。

图6：转录组学与功能遗传学的综合分析

6. 氧化应激信号分辨持续应答

       作者接下来寻找伊美司他反应和耐药的生物标志物。对585个在血液系统恶性肿瘤中频繁突变的基因的综合组织进行基因组测序得到数据，观察到信号传导或细胞粘附/代谢相关基因的致癌突变更频繁（图7a）。突变型NRAS与伊美司他治疗的反应增强有关，与AML PDX中野生型NRAS相比，突变型NRAS减少AML负荷，提高存活率（图7b，c）。此外， AML患者样本中获得的RNA-seq数据进行基因集富集分析（GSEA），发现在持续应答伊美司他的样本中，翻译/病毒感染相关的基因呈阳性富集，细胞周期、抗病毒免疫、跨膜转运和血红素清除相关的基因呈阴性富集（图7d）。Hallmark特征显示，持续应答伊美司他与细胞凋亡、干扰素-α反应、DNA修复、TP53途径、过氧化物酶体、脂肪酸代谢和ROS生成途径有关（图7e）。

       接下来，作者研究了端粒长度是否与伊美司他应答相关。通过端粒限制性片段（TRF）分析确定端粒长度，长度范围在2.7-12 kb，30例AML患者样本中有5例含有多个端粒长度不同的亚克隆（图7f），表明基线端粒长度和伊美司他应答无相关性（图7f）。

       上述结果表明伊美司他在大多AML PDX中有效。此外，对伊美司他的持续应答与基线端粒长度无关，与NRAS突变和氧化应激基因有关。

图7：突变NRAS和氧化应激基因表达特征与对伊美司他的持续应答相关

7. 氧化应激诱导AML PDX对伊美司他敏感

       AML诱导缓解治疗的标准方案是蒽环类药物联合标准剂量阿糖胞苷。为了探究该疗法是否能使AML细胞对伊美司他治疗敏感，作者用阿糖胞苷联合阿霉素预处理AML细胞，随后用伊美司他治疗，发现标准诱导化疗以剂量依赖性的方式显著增加ROS水平和细胞死亡（图8a，b）。

       NRAS野生型AML PDX模型在单剂量标准诱导化疗后使用伊美司他导致体内ROS水平显著增加（图8c）。早期治疗组之间的脂质过氧化没有显著差异（图8c）；但在经过完整的诱导化疗周期后使用伊美司他治疗发现脂质过氧化和ROS水平显著增加（图8d）。

       随后，作者在20例AML患者样本来源的不同PDX（n=480）中依次给予标准诱导化疗，再进行伊美司他治疗（图8e）。与对照治疗、伊美司他单独治疗、单独标准诱导化疗（图8f）相比，联合治疗组的AML负荷显著降低（图8g）。

       上述数据表明用标准诱导化疗诱导氧化应激可使AML细胞对伊美司他诱导的脂质过氧化和铁死亡更敏感，显著改善治疗效果（图8h）。

图8：氧化应激诱导和标准诱导化疗使AML细胞对伊美司他敏感

结论

        通过开发和利用AML PDX资源库和人类细胞系，结合基因组学、转录组学和脂质组学，作者证明伊美司他是铁死亡的诱导剂，可减轻患者AML负荷并延缓化疗后的复发。作者证明对AML患者采用序贯治疗即先采用标准诱导化疗随后利用伊美司他巩固疗效，这一治疗方式可显著延迟或预防AML的复发。后续临床试验将重点关注伊美司他在预防AML复发或与靶向治疗一起改善AML患者预后的作用。

实验方法

小鼠模型，异种移植实验，药物治疗研究，血液分析，流式细胞术，qPCR，细胞培养和体外细胞生长分析，蛋白质印迹，共聚焦显微镜，突变测序，RNA测序，脂质组学

参考文献

Bruedigam C, Porter AH, Song A, et al. Imetelstat-mediated alterations in fatty acid metabolism to induce ferroptosis as a therapeutic strategy for acute myeloid leukemia [published online ahead of print, 2023 Oct 30]. Nat Cancer. 2023;10.1038/s43018-023-00653-5. doi:10.1038/s43018-023-00653-5.