N7-甲基鸟苷tRNA修饰通过RPTOR/ULK1/自噬轴促进食管鳞状细胞癌肿瘤发生

       N7 -甲基鸟苷(m7G)是一种最常见的RNA表观修饰，常位于真核生物mRNA的5’帽和内部位置，或所有物种的rRNA和tRNA内部。m7G修饰通过影响各种RNA分子的代谢，包括mRNA、tRNA、microRNA和核糖体RNA。越来越多的证据表明，m7G在人类疾病的发展中发挥着关键作用。目前m7G中标的项目越来越多，但又不会像其他热点一样被研究的很泛滥，因此不失为基金申请的好方向。下图为22年部分m7G中标项目的题目： 

       METTL1介导的N7-甲基鸟苷tRNA修饰的失调可以促进肿瘤发生。在这里，作者报告说，这种修饰调节了自噬途径的mTOR和负调节因子中蛋白质的翻译，导致食管鳞状细胞癌的进展。

       在这项研究中作者证明METTL1和WDR4表达水平在ESCC中显着上调，并与ESCC不良预后相关。此外，METTL1和WDR4在体外和体内通过tRNA m7G甲基转移酶活性促进ESCC进展。从机制上来讲，从机制上讲，METTL1或WDR4敲低可导致m7G修饰的tRNA表达减少，并减少在RPTOR/ULK1/自噬途径中富集的致癌转录物的翻译。我们的研究证明提供了tRNA的m7G修饰失调在ESCC中的致癌功能，并且提示靶向METTL1以及其下游信号轴可能是ESCC治疗的一个潜在靶点。该研究于22年5月发表于《Nature Communication》 IF：16.6

技术路线

1.METTL1/WDR4 在 ESCC 中上调，并与 ESCC 预后不良相关

       在ESCC病人样本中检查了METTL1 / WDR4的表达，数据显示与邻近正常组织相比，食管鳞状细胞癌肿瘤组织的METTL1/WDR4 和 m7G修饰显著升高（图1A和B）。此外，免疫组化（IHC）染色显示，食管肿瘤组织中METTL1的表达高于邻近正常组织（图1C和D）。此外，METTL1的表达与高肿瘤分级和分期显着相关 （1F-H）。接着研究了METTL1表达与ESCC患者预后的关系,生存分析表明，METTL1高表达与较差的总生存期和无病生存状态相关（图1I和J）。同样，WDR4在ESCC中也上调，并与ESCC患者的不良预后相关（图1K和L）。总的来说，数据显示，METTL1和WDR4在ESCC中显着上调，并与ESCC进展和预后不良相关。

2.敲低METTL1 在异种移植模型中抑制ESCC进展

       ESCC中METTL1表达的升高，因此作者认为METTL1在ESCC进展中起着促进的功能。为了验证这一假设，首先在 KYSE150和KYSE30着两种ESCC 细胞中使用敲低METTL30， 发现敲低METTL1后能够抑制K150和K30细胞增殖（图2B）和集落形成能力（图2C和D）的。此外，流式分析显示，敲低METTL1能够导致 ESCC 细胞凋亡水平增加（图2E和F）。接着利用异种移植小鼠模型探讨了METTL1在体内ESCC进展中的作用，与对照组相比，敲低METTL1组小鼠肿瘤生长明显减缓并且肿瘤大小和重量减小（图2G-I）。免疫组化结果显示，敲低METTL1组的肿瘤中，Ki67水平下降，证明METTL1敲低后降低了ESCC在体内的增殖活性（图2J和K）。综上所述，研究揭示了METTL1在体外和体内ESCC进展中的基本功能，即METTL1与ESCC发展呈现正相关。

3.METTL1在ESCC中调控m7G tRNA修饰、tRNA表达和mRNA翻译

       为了研究METTL1在ESCC进展中功能的分子机制，作者使用之前TRAC-seq 方法(tRNA还原和切割测序)，利用METTL1缺失和对照ESCC细胞分析了总的tRNA m7G修饰水平。在TRACseq数据库中鉴定了19个m7G修饰的tRNA，这些tRNA在可变环中具有“ABGWY”序列(图3A)。METTL1缺失显著降低了tRNA的m7G修饰水平(图3B和C)。RNA质谱分析同样也证实了METTL1敲除的细胞中tRNA m7G修饰水平的降低(图3d)。此外，METTL1的缺失降低了大多数m7g修饰的trna的表达水平，而非m7g修饰的trna的表达几乎没有受到影响此外(图3E和F)。与tracseq数据一致，m7G northwestern和northern实验证实，METTL1敲除细胞中m7G修饰水平降低，m7G修饰trna表达减少（图3G）。此外，野生型METTL1而非其无催化活性的突变体的过表达增加了总m7G tRNA修饰水平和m7G修饰tRNA的表达，证明了METTL1通过其tRNA m7G甲基转移酶活性调控tRNA修饰和表达（图3H）。同样，抑制WDR4导致m7G修饰水平降低，在K150和K30 ESCC细胞中，过表达WDR4增加了m7G tRNA修饰和m7G修饰的tRNA表达(图3I和J)。这些数据均表明了METTL1/WDR4在调节tRNA m7G修饰和表达中的重要功能。

       tRNA在mRNA翻译中起作用，我们接下来确定了METTL1对ESCC细胞mRNA翻译的影响。多聚体分析显示，METTL1敲低细胞的mRNA翻译活性降低，多核糖体峰值降低(图3K)。此外，嘌呤霉素摄入测定也证实，METTL1敲低会降低ESCC细胞的mRNA翻译活性(图3L)。在METTL1缺失的细胞中，重新表达野生型METTL1而不是其突变体恢复了mRNA的翻译效率，证明m7G的催化功能对METTL1促进mRNA翻译至关重要。总的来说，我们的数据表明，mettl1介导的m7G tRNA修饰对ESCC中tRNA的表达和mRNA翻译至关重要。

       为了研究m7G修饰异常而导致的翻译异常所产生的影响，使用METTL1敲除和对照ESCC细胞进行了多聚核糖体测序(图3M)。为了研究mRNA翻译与tRNA m7G修饰之间的联系，计算了测序结果当中mRNA上的 m7G 修饰的 tRNA 所对应的密码子的数量。结果显示，mRNA上m7G修饰的 tRNA 所对应的密码子越多，翻译效率（Translation efficiencies, TE）也就越低。(图3N)。Go分析和KEGG信号通路分析显示TE-down mRNA在自噬生物学过程和mTOR信号通路中显著富集（图3O和P）。值得注意的是，与其他检测到的mrna相比，那些te降低、参与自噬生物学过程或mTOR信号通路的mRNA被m7G修饰的tRNA解码的密码子数量更多(图3Q)。接下来，我们确定了METTL1在调节自噬负调控基因和mTOR信号通路基因表达中的功能。我们的数据显示，METTL1缺失降低了它们的蛋白质表达，但对它们的mRNA影响很小(图3R和S)。此外qPCR实验进一步证实，在METTL1缺失的细胞中，编码mTOR关键成分的RPTOR (mTOR复合物1的调控相关蛋白)的翻译效率显著降低(图3T)。因此，我们随后测定了METTL1敲除细胞中pULK1和自噬标志物微管相关蛋白轻链3 LC3-II和LC3-I的水平。在氯喹(CQ)处理和未处理的K150和K30细胞中，METTL1缺失降低了pULK1水平，增加了LC3-II/LC3-I的比率(图3U和V)，表明METTL1敲除的ESCC细胞中自噬水平增加。这些数据表明，翻译损伤发生在细胞死亡和自噬之前，表明METTL1敲低降低mRNA翻译，从而导致ESCC细胞死亡和自噬。综上所述，我们的数据表明，METTL1以m7G相关密码子依赖的方式促进mTOR信号相关基因的翻译和自噬途径的负调控。

4.在ESCC中，RPTOR是METTL1的重要下游靶点

       我们进一步发现，在METTL1缺失的ESCC细胞中，重新表达RPTOR恢复了增殖和集落形成能力（图4 A- D），此外，RPTOR过表达增加了ULK1磷酸化水平，降低了METTL1缺失细胞中LC3-II/LC3-I的比例，消除了ESCC细胞的自噬通量(图4E-H)。总的来说，这些数据揭示了RPTOR是METTL1的重要下游靶点，并进一步支持了METTL1介导的tRNA m7G修饰通过调控RPTOR促进ESCC进展。因为RPTOR可以在METTL1敲低的ESCC细胞中挽救ULK1的磷酸化水平并减少自噬，接下来在METTL1缺失的ESCC细胞中敲低ULK1，以确定METTL1和RPTOR是否通过调节ULK1介导的自噬来促进ESCC的进展(图4I)。结果表明，抑制ULK1可以挽救METTL1缺失的ESCC细胞的生长(图4J)，进一步证明METTL1和RPTOR通过ULK1调节ESCC的进展。此外，自噬通量检测显示，敲低ULK1可以消除METTL1缺失的ESCC细胞中增加的自噬通量(图4K-M)。总的来说，我们的数据揭示了RPTOR/自噬轴在介导METTL1在ESCC进展中的功能中的重要作用。

5.敲除 METTL1抑制ESCC肿瘤发生

       为了在体内直接探索m7G tRNA修饰在ESCC肿瘤发生中的作用，构建组织特异性Mettl1敲除小鼠模型。在使用他莫昔芬诱导Mettl1敲除后，Mettl1敲除和对照小鼠分别使用DNA烷基化剂二乙基亚硝胺(DEN)和多激酶抑制剂索拉非尼(sorafenib)诱导ESCC发生肿瘤32(图5A)。经DEN处理8周，索拉非尼处理12周后，发现对照组小鼠食管发生了明显的病理变化，而Mettl1敲除小鼠的病变面积和ESCC数量明显减少(图5A-E)。组织学分析显示，Mettl1敲除小鼠肿瘤中METTL1和Ki67染色水平降低(图5F和G)。我们还发现，Mettl1敲除降低了小鼠肿瘤中m7G tRNA修饰，降低了RPTOR蛋白水平(图5H-J)，这些数据支持METTL1和m7G tRNA修饰在体内调节RPTOR mRNA的翻译和RPTOR下游靶点的活性。值得注意的是，敲除组肿瘤中LC3蛋白水平明显高于对照组(图5L和M)，表明Mettl1敲除导致体内自噬增加。总之，这些结果支持METTL1介导的m7G tRNA修饰在促进ESCC体内肿瘤发生中的关键功能。

6.METTL1/WDR4介导的m7G tRNA修饰促进ESCC进展

       为了进一步加强m7G tRNA修饰与ESCC进展之间的功能联系，我们进行了功能获得研究(图6A)。我们的数据显示，强制表达野生型METTL1而非其催化死突变体可以促进ESCC细胞的生长和集落形成(图6B-E)。此外，过表达METTL1而非其突变体上调RPTOR蛋白表达，减少细胞凋亡和自噬(图6F-I)。总的来说，我们的数据显示tRNA m7G的催化功能对于METTL1调节靶表达和ESCC进展至关重要。然后，我们在ESCC细胞中过表达WDR4，以进一步证实m7G tRNA修饰促进ESCC进展的结论。我们的数据显示，过表达WDR4可以稳定METTL1蛋白的表达，并增加下游靶点RPTOR的表达(图6J)。METTL1调节tRNA m7G修饰、tRNA表达和致癌mRNA翻译。ESCC细胞生长和集落形成(图6K-M)。这些数据支持WDR4是促进ESCC进展的重要癌基因。总之，我们的研究结果有力地支持了METTL1/WDR4介导的m7G tRNA修饰在ESCC进展调控中的重要致癌功能。

7.METTL1促进体内ESCC原位瘤的发生

       我们进一步建立了METTL1条件敲除蛋白小鼠模型，并诱导ESCC肿瘤发生，探讨METTL1在ESCC肿瘤发生中的作用。DEN/sorafenib治疗18周后(图7A)， METTL1敲除小鼠的食道出现了大量的肿瘤，而对照组小鼠的食道只发生了少量和较小的病变(图7B和C)。此外，敲除小鼠的异常增生和鳞状细胞癌的数量明显高于对照组(图7D和F)。组织学分析显示cKI小鼠肿瘤中METTL1表达水平较高增殖活性高于对照小鼠(图7G和H)。我们进一步发现，与对照小鼠相比，敲除小鼠肿瘤中m7G tRNA修饰和m7G修饰tRNA的表达升高(图7I)。此外，在METTL1 cKI小鼠肿瘤中，RPTOR蛋白水平升高，而mRNA水平未见升高(图7J-M)。综上所述，这些结果揭示了METTL1m7G tRNA修饰促进了ESCC在体内的肿瘤发生和发展。

结论

       总的来说作者认为tRNA m7G修饰可以通过调控细胞自噬最终促进ESCC的发生。METTL1可能是ESCC患者的一个有希望的治疗靶点

实验方法

免疫组化，免疫荧光染色，qRT-PCR ，Western blot，Northwestern blot，Northern blot，多核糖体分析，TRAC-seq，多核糖体测序，ribo-seq，自噬通量检测，流式检测凋亡细胞，克隆形成，细胞增殖，小鼠皮下成瘤，小鼠基因敲除

参考文献

Han H, Yang C, Ma J, et al. N7-methylguanosine tRNA modification promotes esophageal squamous cell carcinoma tumorigenesis via the RPTOR/ULK1/autophagy axis. Nat Commun. 2022;13(1):1478. Published 2022 Mar 18.