SUCLG2通过琥珀酰化调控肺腺癌线粒体功能障碍

        线粒体功能障碍和能量代谢异常是癌症的主要特征。然而，癌症进展过程中线粒体功能障碍的机制远未阐明。本文证明，琥珀酰辅酶A（CoA）合成酶GDP形成亚基β（SUCLG2）的表达水平会影响肺腺癌（LUAD）细胞的整体琥珀酰化。琥珀酰化组分析表明，缺失SUCLG2可上调线粒体蛋白的琥珀酰化水平，并通过降低酶活性或蛋白稳定性来抑制关键代谢酶的功能，从而抑制LUAD细胞的线粒体功能。有趣的是，SUCLG2本身也会在Lys93上发生琥珀酰化，这种琥珀酰化会增强其蛋白质的稳定性，从而导致SUCLG2的上调，促进LUAD细胞的增殖和肿瘤发生。Sirtuin 5（SIRT5）对SUCLG2的Lys93进行脱琥珀酰化，然后由含三方基序蛋白21（TRIM21）通过K63连接介导泛素化，并在溶酶体中降解。研究结果揭示了SUCLG2在线粒体功能障碍中的新作用，阐明了SUCLG2在LUAD中琥珀酰化介导的蛋白质平衡机制，从而为开发针对SUCLG2的抗癌药物提供了理论依据。本文于2023年10月发表于《Advanced Science》，IF=15.1。

技术路线

实验结果

1. SUCLG2是LUAD细胞增殖的必要条件，与LUAD患者的不良生存率密切相关

        GDP特异性琥珀酰-CoA合成酶（SUCLG2）和ATP特异性琥珀酰-CoA合成酶（SUCLA2）是琥珀酰-CoA合成酶的两个不同的β亚基。为了研究SUCL在LUAD 中的作用，作者首先检测了SUCLG2和SUCLA2在LUAD细胞和组织中的蛋白表达,作者发现，与人类支气管上皮细胞系BEAS-2B相比，SUCLG2在所有LUAD细胞中的蛋白表达均显著上调。与BEAS-2B相比，SUCLA2在一些LUAD细胞中上调，但在另一些细胞中则下调，而且未发现一致的趋势（图1A）。当作者检测LUAD组织中SUCLG2和SUCLA2的表达时，也得到了类似的结果。图1B显示，SUCLG2在LUAD组织中的表达高于邻近的正常组织，而SUCLA2在大多数组织对中无明显变化。为了研究SUCLG2和SUCLA2在LUAD细胞增殖中的功能，作者使用CRISPR-Cas9技术删除了A549和H1299细胞中的SUCLG2或SUCLA2。然后，作者进行了细胞增殖实验，当SUCLG2而非SUCLA2被敲除时，LUAD细胞的增殖率明显下降（图1C,D）。因此，这些结果表明，SUCLG2 而不是SUCLA2在LUAD中起着重要作用。

        作者还进行了异种移植试验，以确定A549野生型（WT）和SUCLG2基因敲除（SUCLG2-KO）细胞的肿瘤发生情况。与A549-WT细胞相比，A549 SUCLG2-KO的肿瘤重量和体积均有所下降（图1E-G）。为了证实这些结果，作者使用抗Ki67、抗TTF1和抗SUCLG2抗体对A549-WT和A549-SUCLG2-KO的肿瘤样本进行了免疫组化（IHC）分析。Ki67在病理评估中被广泛用作增殖标志物，而TTF1在高级别LUAD中经常被抑制。作者的结果显示，A549-WT组的Ki67和SUCLG2染色明显高于A549-SUCLG2-KO组。然而，A549-WT组的TTF1染色低于A549-SUCLG2-KO组（图1H）。为了进一步确定SUCLG2在LUAD中的高表达是否具有临床意义，作者使用抗SUCLG2抗体通过IHC检测了SUCLG2在LUAD组织阵列中的蛋白表达。该组织阵列包括来自90名LUAD患者的肺癌组织和邻近的正常组织。结果表明，与邻近的正常组织相比，肿瘤组织表达的SUCLG2水平明显更高（图1I）；染色定量进一步验证了这一结果（图1J）。对癌症组织染色定量结果的统计分析根据SUCLG2水平将样本分为两组。患者生存率与 SUCLG2 水平相关。如图1K所示，SUCLG2水平低的患者比SUCLG2水平高的患者生存率更高（P = 0.0252）。这些结果表明，SUCLG2影响LUAD细胞的增殖和肿瘤发生，并与LUAD的进展和患者生存密切相关。

2. SUCLG2 缺乏导致线粒体功能障碍

        线粒体是新陈代谢活动的核心细胞器，而SUCLG2是TCA循环中的一个关键酶。因此，作者推测SUCLG2可能会通过调节线粒体代谢来影响肿瘤的增殖。作者对A549-WT和A549-SUCLG2-KO细胞进行了非靶向代谢组学研究，发现与A549-WT细胞相比，A549-SUCLG2-KO细胞中有15种代谢物上调，64种代谢物下调（图2A）。作者利用KEGG通路分析对代谢物进行了分析，发现线粒体相关代谢通路如TCA循环和谷胱甘肽代谢发生了显著变化（图2B）。为了检测SUCLG2对线粒体功能的影响，作者进行了透射电子显微镜（TEM）检查，结果发现，A549细胞中的线粒体呈管状，嵴清晰，而A549-SUCLG2-KO细胞中的线粒体肿胀，嵴断裂（图2C）。作者发现在A549和H1299细胞中敲除SUCLG2会降低mtDNA水平（图2D）。此外，与对照细胞相比，SUCLG2-KO 细胞中的细胞ROS水平升高（图2E）。敲除SUCLG2后，A549和H1299细胞中的ATP含量下降（图2F）。随后，作者测量了敲除SUCLG2 的A549和H1299细胞的线粒体膜电位（MMP）。与对照细胞相比，SUCLG2基因敲除细胞的线粒体膜电位明显降低（图2G）。从这些结果中，作者得出结论，LUAD细胞线粒体功能的维持依赖于SUCLG2的表达。

3. SUCLG2基因敲除诱导蛋白质琥珀酰化的全面增加

        SUCLG2是琥珀酰-CoA的主要水解酶，而琥珀酰-CoA是蛋白质琥珀酰化的主要琥珀酰修饰底物。琥珀酰化被认为是一种受琥珀酰-CoA供体浓度调节的非酶促反应。因此，作者推测SUCLG2可能通过琥珀酰化调节线粒体功能和代谢重编程。由于琥珀酰-CoA会被氧化水解，因此很难检测到。因此，作者在敲除SUCLG2的A549和 H1299细胞中检测了由SUCLG2催化的琥珀酰-CoA产物琥珀酸的含量。图3A显示，SUCLG2基因敲除明显降低了琥珀酸的含量。接下来作者研究了SUCLG2对细胞内蛋白质琥珀酰化水平的影响。结果显示，SUCLG2基因敲除增加了细胞内蛋白质的琥珀酰化水平（图3B）。然后，作者进行了琥珀酰4D质谱分析，以进一步研究受SUCLG2调控的蛋白质的琥珀酰化情况。结果发现，在SUCLG2基因敲除的细胞中，285个蛋白质中有686个琥珀酰赖氨酸（K-su）位点，44个蛋白质中有61个不同表达的琥珀酰化位点。作者发现，与A549-WT细胞相比，在A549-SUCLG2-KO细胞中发现的大部分琥珀酰化上调，61%分布在线粒体中（图3C）。GO分析表明，线粒体相关的代谢途径，如能量产生和转化，发生了显著变化（图3D）。与线粒体功能相关的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、NAD依赖性苹果酸酶（ME2）、异柠檬酸脱氢酶（IDH2）、苹果酸脱氢酶（MDH2）和酰辅酶 A 硫代酯酶9（ACOT9）等关键酶的琥珀酰化在特定位点显著上调（图3E-J）。这些结果表明，SUCLG2基因敲除促进了与线粒体功能相关的蛋白质的琥珀酰化。

4. SUCLG2通过调节琥珀酰化影响蛋白质的稳定性或酶活性

        接下来，作者研究了SUCLG2对GAPDH、ME2、IDH2、MDH2和ACOT9等关键酶功能的影响。作者首先检测了SUCLG2对这些蛋白质琥珀酰化的影响，以验证琥珀酰4D质谱分析结果。结果显示，SUCLG2敲除会增加GAPDH、ME2、IDH2、MDH2和ACOT9的琥珀酰化（图4A-E），而在A549细胞中过表达SUCLG2会降低这些蛋白的琥珀酰化（图4F-J）。这些结果证实，SUCLG2调控线粒体相关蛋白的琥珀酰化。接下来，作者研究了SUCLG2如何影响这些代谢酶的功能。首先，作者用Western印迹法检测了SUCLG2敲除的A549和H1299细胞中GAPDH、ME2、IDH2、MDH2和ACOT9的表达。图4K显示，SUCLG2基因敲除降低了ME2和ACOT9的蛋白表达，而GAPDH、IDH2和MDH2的表达未受影响。为了确定SUCLG2如何调控ME2和ACOT9的表达，作者测定了A549-WT和A549-SUCLG2-KO细胞中ME2和ACOT9的稳定性。结果显示，与A549-WT细胞相比，ME2和ACOT9蛋白在A549-SUCLG2-KO细胞中的降解速度更快（图4L）。为了进一步证实蛋白质的稳定性受琥珀酰化的调控，作者对ACOT9（K157R，K294R）和ME2（K26R，K94R）的琥珀酰化位点进行了点突变，这些突变位点是通过琥珀酰4D质谱分析结果确定的。由于GAPDH、IDH2和MDH2的表达不受SUCLG2敲除的影响，作者接下来检测了这些酶的酶活性。敲除SUCLG2会降低A549和H1299细胞中GAPDH、ME2、IDH2 和MDH2的活性（图4M-P）。这些结果表明，敲除SUCLG2会降低酶活性或蛋白质稳定性，从而抑制与线粒体功能相关的关键代谢酶的功能。

5. TRIM21通过K63-连接泛素化介导的溶酶体途径诱导SUCLG2降解

        作者进行了环己亚胺（CHX）酶切实验，检测SUCLG2蛋白在LUAD细胞系（A549、HCC827和H1299）和BEAS-2B细胞中的稳定性。结果显示，与A549、HCC827和H1299细胞相比，SUCLG2蛋白在BEAS-2B细胞中的降解速度明显加快（图5A）。这些结果表明，SUCLG2在LUAD中的高表达是由于蛋白质稳定性的增强。因此，作者研究了SUCLG2的降解途径。作者发现，用CHX处理A549细胞24小时后，SUCLG2的蛋白水平明显下降，加入溶酶体抑制剂氯喹（CQ）后可以恢复，但蛋白酶体抑制剂MG132不能恢复（图5B）。此外，作者通过加入MG132或CQ检测了SUCLG2的泛素化水平，发现加入CQ而不是MG132 时，SUCLG2的泛素化显著增加（图5C）。然后作者检测了泛素化类型，发现在用CQ处理的A549细胞中，SUCLG2的K63-连接泛素化上调（图5D）。这些结果表明，SUCLG2蛋白是通过K63链接泛素化介导的溶酶体途径降解的。

        为了确定SUCLG2的E3连接酶，作者进行了质谱分析，发现TRIM21是一种推定的SUCLG2相互作用蛋白（图5E）。作者利用免疫沉淀技术验证了 SUCLG2 与 TRIM21在A549细胞中的相互作用（图5F）。然后，作者检测了过表达或敲除TRIM21时SUCLG2 的蛋白水平。结果显示，过表达TRIM21会降低A549细胞中SUCLG2蛋白的表达（图5G）。此外，过表达TRIM21会加快CHX处理后SUCLG2的降解速度（图5H）。同时，作者发现在LUAD细胞和BEAS-2B细胞中，TRIM21和SUCLG2的蛋白表达呈负相关（图5I）。在LUAD组织中也观察到了类似的趋势。TRIM21的蛋白表达与SUCLG2、SIRT5和SUCLG2呈负相关，未见一致趋势（图5J）。作者进一步探讨了TRIM21介导的SUCLG2泛素链连接类型，过表达TRIM21增加了 SUCLG2的K63连接泛素化（图5K）。总之，这些数据支持 TRIM21 通过 K63 连接泛素化 SUCLG2，然后通过溶酶体降解的模型。

        作者接下来确定了受TRIM21调控的SUCLG2泛素化位点。利用 PhosphoSitePlus，作者确定了K101、K118、K132、K200和K386为SUCLG2的推定泛素化位点（图 5L）。然后，作者构建了含有指定突变（K101R、K118R、K132R、K200R和K386R）的SUCLG2质粒。作者发现，当TRIM21被过表达时，只有SUCLG2K200R的泛素化没有发生变化（图5M）。接下来，作者测量了野生型SUCLG2（SUCLG2WT）和 SUCLG2K200R 突变体的稳定性。在用CHX处理细胞时，SUCLG2K200R 的降解速度比 SUCLG2WT 慢得多。此外，TRIM21的过表达并不能提高SUCLG2K200R的降解率（图5N）。这些数据表明，SUCLG2的K200是TRIM21的主要泛素化位点。

6. SUCLG2的K93-琥珀酰化影响TRIM21介导的SUCLG2降解

        SUCLG2定位于线粒体基质，是将琥珀酰-CoA转化为琥珀酸的关键。因此，作者推测琥珀酰化会影响SUCLG2的功能。首先，作者利用共转印证明了SUCLG2蛋白可被琥珀酰化（图6A）。利用PhosphoSitePlus和质谱分析结果，作者确定K78、K93和K338为SUCLG2的假定琥珀酰化位点（图6B）。为了确定SUCLG2的主要琥珀酰化位点，作者构建了含有所述突变（K78R、K93R 和 K338R）的SUCLG2质粒，发现与SUCLG2WT相比，只有SUCLG2K93R的琥珀酰化减少（图6C）。接下来作者测量了SUCLG2WT和SUCLG2K93R的稳定性。用CHX处理细胞时，SUCLG2K93R蛋白水平的下降速度比SUCLG2WT快（图6D）。这些结果表明，SUCLG2的K93是SUCLG2的主要琥珀酰化位点，其突变会降低蛋白在LUAD细胞中的稳定性。

        作者接下来探讨了SUCLG2的琥珀酰化是否会调控其泛素化。作者进行了联合泛素化检测，发现与SUCLG2WT相比，SUCLG2K93R的泛素化作用更强（图6E）。这一结果表明，SUCLG2K93R突变体影响了SUCLG2的泛素化。作者还发现TRIM21更倾向于结合SUCLG2K93R并增加其泛素化（图6F和G）。此外，与SUCLG2WT相比，SUCLG2K93R结合了更多的p62（图 6H）。这些结果证实，SUCLG2K93R通过增加 TRIM21介导的泛素化和溶酶体降解来促进其降解。

7. SIRT5 是SUCLG2的脱琥珀酰化酶并影响其蛋白稳定性

        脱琥珀酰化主要由依赖NAD+ 的SIRT家族调控。作者试图确定哪种SIRT参与了SUCLG2的脱琥珀酰化。迄今为止，已有报道称SIRT5和SIRT7是线粒体中的脱琥珀酰化酶。作者研究了SIRT5和SIRT7是否能使SUCLG2去琥珀酰化并影响其功能。在过表达SIRT5的细胞中，琥珀酰化的SUCLG2水平明显低于含有空载体的细胞（图7A）。图7B显示，敲除SIRT5增加了SUCLG2的琥珀酸化。接下来，作者通过共显微镜（co-IP）验证了SUCLG2和SIRT5之间的相互作用。结果显示，SUCLG2 和SIRT5相互作用（图 7C、D）。为了进一步验证它们之间的相互作用，作者进行了免疫荧光和线粒体分离试验。结果显示，SIRT5与SUCLG2在线粒体中共位（图 7E和F），表明SIRT5与SUCLG2相互作用。

        作者接下来探讨了SIRT5和SUCLG2之间的关系。首先，过表达或敲除SIRT5，并检测SUCLG2的表达。敲除SIRT5导致SUCLG2蛋白水平升高，而过表达SIRT5 则降低了SUCLG2的表达（图7G、H）。利用CHX阻断SUCLG2的蛋白合成，作者发现过表达SIRT5会加速SUCLG2的降解（图7I）。接着，作者发现过表达SIRT5 会显著增加SUCLG2的泛素化水平（图7J），而敲除SIRT5则会减少SUCLG2的泛素化（图7K）。作者进一步检测了SIRT5诱导的SUCLG2泛素链的类型。过表达 SIRT5增加了SUCLG2的K63连接泛素化（图7L）。作者还利用共转录分析发现，在A549细胞中，过表达SIRT5可促进SUCLG2与TRIM21和p62的结合（图7M,N）。这些结果表明，SIRT5通过K63连接泛素化SUCLG2，然后通过溶酶体途径降解。

        接下来，作者探讨了SIRT5与SUCLG2K93R 之间的关系。作者发现SIRT5并不影响SUCLG2K93R的琥珀酰化（图7O）。综上所述，这些结果表明SIRT5是SUCLG2 在Lys93上的脱琥珀酰化酶，促进了TRIM21介导的SUCLG2降解。

8. 抑制SUCLG2在K93上的琥珀酰化会导致LUAD细胞线粒体功能障碍并减少肿瘤发生

        为了进一步研究TRIM21是否通过调控SUCLG2的泛素化和降解来影响肿瘤的发生，作者在A549和H1299细胞中过表达了TRIM21和SUCLG2，细胞生长实验显示，过表达TRIM21抑制了A549和H1299细胞的生长。然而，SUCLG2的表达克服了过表达TRIM21对细胞增殖的抑制作用（图8A,B）。同样，SIRT5也会抑制A549和H1299细胞的生长，而SUCLG2会降低过表达SIRT5对细胞生长的抑制作用（图8C和D）。这些结果表明，SUCLG2介导了SIRT5和TRIM21对LUAD细胞增殖的功能。为了给开发靶向SUCLG2的抗肿瘤药物提供理论依据，作者去除了内源性SUCLG2，并将野生型SUCLG2（SUCLG2WT）或SUCLG2K93R突变体稳定地重新导入A549细胞（图8E）。作者评估了SUCLG2K93R 突变体对线粒体功能的影响，并使用 TEM观察线粒体的形态变化。A549-SUCLG2WT细胞中的线粒体嵴完整，形态特征正常。然而，A549-SUCLG2K93R细胞中的线粒体出现空泡化和肿胀，嵴断裂（图8F）。为了进一步确定线粒体质量的差异，作者检测了A549-SUCLG2WT和A549-SUCLG2K93R细胞的mtDNA拷贝数。作者发现，与A549-SUCLG2WT细胞相比，A549-SUCLG2K93R细胞的mtDNA拷贝数减少了（图8G）。作者还发现，与 A549-SUCLG2WT 细胞相比，ROS 在 A549-SUCLG2K93R 细胞中明显积累（图 8H）。A549-SUCLG2WT细胞中的ATP含量高于A549-SUCLG2K93R细胞（图8I）。作者的研究结果表明，A549-SUCLG2WT 的线粒体功能优于 A549-SUCLG2K93R。接下来，作者在 A549-SUCLG2WT 和 A549-SUCLG2K93R 细胞中进行了细胞增殖试验。结果显示，SUCLG2K93R 突变体抑制了细胞增殖（图 8J）。然后，作者在异种移植模型中评估了 A549-SUCLG2K93R 细胞的肿瘤发生情况。与A549-SUCLG2WT相比，A549-SUCLG2细胞的异种移植物显示肿瘤重量和体积减少（图8K-M），IHC结果显示，与SUCLG2WT肿瘤相比，SUCLG2K93R突变体肿瘤的Ki67表达减少，TTF1表达增加（图8N）。这些结果表明，抑制SUCLG2在K93上的琥珀酰化会导致线粒体功能障碍，减少LUAD细胞的肿瘤发生。

结论：

        综上所述，作者的研究阐明了SUCLG2在线粒体功能障碍中的作用，阐明了SUCLG2在LUAD中琥珀酰化介导的蛋白平衡机制，从而为开发靶向SUCLG2的抗肿瘤药物提供了理论依据。

实验方法：

        RT-qPCR检测、免疫印迹和蛋白质印迹、免疫荧光检测、免疫组化、mtDNA提取和分析、ATP生产测量、线粒体和胞质溶胶提取、MDH2活性的测量、IDH2活性的测量、ME2活性的测量、GAPDH活性的测量、琥珀酰基4D质谱分析、非靶向代谢组学、细胞培养和转染、细胞增殖检测、transwell迁移检测和划痕伤口愈合检测、CRISPR-Cas9介导的基因破坏、细胞内ROS检测、体内异种移植检测

参考文献：

        Hu, Q., Xu, J., Wang, L., Yuan, Y., Luo, R., Gan, M., Wang, K., Zhao, T., Wang, Y., Han, T., Wang, J.-B., SUCLG2 Regulates Mitochondrial Dysfunction through Succinylation in Lung Adenocarcinoma. Adv. Sci. 2023, 2303535.