m6A修饰的BACE1-AS通过TUFT1依赖的Wnt信号通路激活促进结直肠癌的肝转移和干性

        结直肠癌（CRC）是全球第三大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第二大原因。40%的结直肠癌患者发生频繁转移。肝脏是结直肠癌转移最常见的远处靶器官之一。新辅助治疗和其他治疗结直肠癌的新疗法是在近几十年发展起来的。然而，仍有一定比例的患者发生肝转移，迫切需要研究驱动结直肠癌肝转移的新因素和潜在分子机制。非编码RNA在结直肠癌肝转移中发挥重要作用，进一步研究CRC转移特异性非编码RNA及其分子调控机制有望为CRC肝转移提供新的生物标志物和治疗靶点。β-分泌酶1反义RNA（BACE1-AS）是由β-分泌酶1反义链（BACE1）转录而来的长链非编码RNA。近年来越来越多证据表明BACE1-AS参与调控肿瘤的生物学过程。BACE1-AS也是肿瘤发生的免疫相关影响因素。然而BACE1-AS在CRC中的作用尚不清楚。Tuftelin 1（TUFT1）被认为是牙齿组织发育和矿化的关键调节因子，也被认为是多能性相关基因。虽然有少数研究报道TUFT1通过PI3K/AKT通路和AKT/GSK-3β/p65轴促进CRC进展，但TUFT1在CRC中上调的机制以及TUFT1在CRC中的作用尚未发现。该研究发表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF：11.3。

技术路线：

主要研究结果：

1. 转移性CRC中升高的BACE1-AS可通过m6A修饰稳定

        为了揭示与结直肠癌转移相关的失调的lncRNA谱，研究者从基因表达综合数据库（GEO）获得了微阵列数据集GSE109910，并确定了转移性结直肠癌组织样本和非转移性样本之间的116个差异表达的lncRNA（图1A，B）。它对所有del中与较差总生存率相关的上调最明显的lncrna进行了排序（图1C）。与TCGA数据库中的正常组织相比，CRC中上调的BACE1-AS表达证实了这一观察结果（图1D）。在收集的肝转移和非转移CRC样本（图1E-G），以及高转移CRC细胞株（SW620，LoVo）和低转移CRC细胞株（SW480，HCT116）或CCD841 CoN人正常结肠上皮细胞（图1H）中进一步验证了它。BACE1-AS在结直肠癌肝转移中起重要作用。

        N6-甲基腺苷（m6A）修饰被认为是调节RNA稳定性的保守内转录修饰。通过序列突变，研究者在BACE1-AS的155nt和790nt发现了两个可能的m6A基序（图1I），这表明m6A修饰可能促进BACE1-AS的稳定性，从而增加转移性CRC细胞中BACE1-AS的水平。为了验证这一假设，使用m6A抗体的RNA结合蛋白免疫沉淀试验（RIP）表明，BACE1-AS比IgG对照的富集约11.2倍（图1J），表明BACE1-AS的m6A修饰。此外，肝转移性CRC的m6A修饰水平显著高于非转移性CRC，这表明在肝转移性CRC中，提高BACE1-AS水平需要m6A修饰（图1K-L）。为了了解这两个可能的m6A基序是否都被修饰，研究者通过“A”到“T”的突变产生了单位点或双位点突变BACE1-AS(图1H)。用Actinomycin D转染野生型或突变型BACE1-AS表达载体的SW620细胞不同时间后，提取总RNA。如图1L所示，BACE1-AS在单突变组中衰减比野生型组快，而双突变导致比单突变BACE1-AS组衰减更快（图1M），这表明在CRC细胞中维持BACE1-AS稳定性都需要两个m6A基序。在结直肠癌肝转移中，155nt和790nt的m6A修饰导致BACE1-AS表达上调。

图1 m6A修饰促进转移性CRC中BACE1-AS升高

2. IGF2BP2是m6A介导的BACE1-AS稳定所必需的

        通过分析ENCORI数据库，研究者发现IGF2BP2（m6A读取器和RNA稳定剂）是一种潜在的BACE1-AS结合蛋白（图2A）。IGF2BP2在转移性CRC中增加（图2B，C），并与BACE1-AS表达呈正相关（图2D，E）。此外，较高的IGF2BP2水平与较差的预后相关（图2F）。IGF2BP2抗体RIP检测显示，与IgG对照相比，BACE1-AS极度富集（图2G）。为了研究BACE1-AS和IGF2BP2之间的相互作用，研究者用S1M标记BACE1-AS，S1M是链亲和素结合适配体S1衍生的生物素样适配体。然后，将S1M标记的BACE1-AS转染SW620细胞，并使用链霉亲和素珠对细胞提取物进行下拉实验。IGF2BP2抗体免疫印迹检测到特异性阳性条带（图2H），代表IGF2BP2/BACE1-AS的天然相互作用。然而，BACE1-AS中的m6A单突变体减弱了这一阳性条带强度，而双突变体导致了阴性结局（图2H）。这些观察表明IGF2BP2可以通过两个m6A位点与BACE1-AS结合。接下来，研究者研究了IGF2BP2是否保护BACE1-AS免受RNA降解。IGF2BP2的缺失加速了BACE1-AS的衰减（图2I），而IGF2BP2的过表达抑制了BACE1-AS的衰减（图2J）。此外，m6A基序突变消除了IGF2BP2对BACE1-AS的保护作用（图2K）。这些数据进一步支持IGF2BP2是m6A介导的BACE1-AS稳定所必需的。

图2 IGF2BP2结合并促进转移性CRC中BACE1-AS的稳定性

3. BACE1-AS促进结直肠癌肝转移

        为了研究BACE1-AS在CRC肝转移中的生物学作用，研究者对携带BACE1-AS的慢病毒或空病毒感染的HCT116细胞进行了转移测定。伤口愈合实验显示BACE1-AS过表达后的更快愈合速度（图3A）。此外，Transwell实验显示过表达BACE1-AS的细胞具有更高的迁移和侵袭能力（图3B）。相反，在SW620细胞中，通过携带靶向BACE1-AS的shRNA的慢病毒感染敲低BACE1-AS抑制了细胞的迁移和侵袭（图3C，D）。

      研究者构建了BACE1-AS敲除的SW620细胞，以更好地表征BACE1-AS在CRC转移中的作用。BACE1-AS敲除导致细胞侵袭和迁移显著减少（图3E）。值得注意的是，这些下降的转移表型可以通过外源性表达野生型BACE1-AS恢复（图3E）。然而，m6A基序突变的BACE1-AS不能恢复BACE1-AS敲除细胞的转移能力（图3E），表明m6A修饰对BACE1-AS促进CRC肝转移至关重要。有趣的是，在BACE1-AS敲除细胞中，IGF2BP2的缺失消除了BACE1-AS过表达促进的转移增强（图3F）。

      接下来，研究者将BACE1-AS敲除的SW620细胞和亲本SW620细胞注射到NOD SCID小鼠的脾脏中，研究BACE1-AS在体内促进结直肠癌肝转移的作用。饲养6周后处死小鼠，计数肝脏转移结节数量。正如预期的那样，注射亲代SW620的NOD SCID小鼠在肝脏中产生了一定数量的转移结节（图3G）。然而，BACE1-AS的缺失显著抑制了SW620细胞的转移，其特征是肝脏中转移结节的数量减少（图3G）。这些数据表明BACE1-AS在结直肠癌肝转移中起关键作用。

图3 BACE1-AS促进结直肠癌体内外转移

4. BACE1-AS促进结直肠癌细胞的干性

        癌症干细胞已被提出可促进CRC转移。因此，研究者进一步研究BACE1-AS是否促进CRC细胞的干性。与对照细胞相比，通过慢病毒感染的BACE1-AS异位表达显著增加了肿瘤球的形成，在球的数量和球的直径（图4A）。BACE1-AS过表达显著增加了包括NANOG和OCT4在内的干性相关因子的蛋白水平（图4B）。相反，BACE1-AS敲除细胞表现出较弱的成球能力（图4C）和降低的干性相关因子的蛋白水平（图4D）。此外，在BACE1-AS敲除细胞中恢复BACE1-AS恢复了肿瘤球形成能力和NANOG，OCT4的表达（图4E，F）。这些数据表明，BACE1-AS促进了CRC细胞的干性，这可能有助于CRC的肝转移。

图4 BACE1-AS促进结直肠癌细胞的干性

5. BACE1-AS通过TUFT1促进结直肠癌肝转移

        作为竞争性内源RNA（ceRNA）促进靶mRNA表达是lncRNA发挥作用的关键机制。LncACTdb 3.0数据库识别出潜在的BACE1/TUFT1 ceRNA网络轴。有BACE1-AS/TUFT1轴的CRC患者的总生存期比没有这一ceRNA网络的患者短（图5A）。此外，TUFT1缺失导致的这些表型与BACE1-AS缺失一致，提示BACE1-AS可能通过促进TUFT1促进结直肠癌细胞肝转移。为了验证这一假设，研究者检测了BACE1-AS敲除细胞中TUFT1的表达。正如预期的那样，与亲本细胞相比，BACE1-AS敲除细胞中的TUFT1表达显著降低（图5B）。外源性表达TUFT1（图5C）恢复了BACE1-AS敲除SW620细胞的迁移和侵袭能力（图5D）。此外，通过形成的肿瘤球的数量和大小分析，TUFT1过表达还恢复了BACE1-AS敲除的SW620细胞的干性特征（图5E）。重要的是，TUFT1过表达还恢复了BACE1-AS敲除细胞在体内的肝转移（图5F）。这些数据进一步表明BACE1-AS通过TUFT1促进结直肠癌细胞的肝转移。

图5 BACE1-AS通过TUFT1促进结直肠癌转移

6. BACE1-AS促进TUFT1依赖的Wnt信号通路激活

        为了探索BACE1-AS调控的参与CRC肝转移的信号通路，研究者获得了微阵列数据集GSE224235，对比匹配的原发灶和肝转移灶，发现几个调节干细胞多能性的信号通路对CRC肝转移至关重要，其中Wnt信号通路（图6A-B）。qRT-PCR分析证实，与非转移性CRC样本相比，在转移性CRC细胞中，参与Wnt信号通路的蛋白编码的mRNA表达上调，包括WNT3A，WNT7B，CTNNB1，MYC，SOX2和FOSL1（图6C）。蛋白质印迹分析表明，β-catenin，c-Myc，SOX2和FOSL1的蛋白水平反映了mRNA水平的一致变化（图6D）。

        有研究表明Wnt信号通路对肿瘤转移和干性维持至关重要。因此，研究者研究BACE1-AS的促转移功能是否依赖于Wnt信号通路。BACE1-AS敲除显著降低了GSK3β的磷酸化以及β-catenin和Wnt信号通路下游靶基因SOX2和c-Myc的蛋白水平（图6E）。此外，BACE1-AS修复恢复了BACE1-AS敲除细胞中降低的β-catenin，SOX2和c-Myc水平（图6E）。有趣的是，TUFT1敲低抑制了GSK3β的磷酸化，进而降低了Wnt信号下游靶点的蛋白水平（图6F），而TUFT1过表达则表现出相反的作用（图6G），表明TUFT1是Wnt信号通路的上游调节因子。值得注意的是，BACE1-AS过表达诱导的Wnt信号通路的过度激活可以被TUFT1缺失所逆转（图6H），表明BACE1-AS以TUFT1依赖的方式激活Wnt信号通路。

图6 BACE1-AS促进TUFT1依赖的Wnt信号通路激活

7. 药物抑制Wnt信号通路可抑制BACE1-AS促进的结直肠癌干性和肝转移

        接下来，研究者研究了Wnt信号通路的激活是否对BACE1-AS促进结直肠癌肝转移至关重要。正如预期的那样，在BACE1-AS敲除的SW620细胞中，通过CT99021处理（10μM）重新激活Wnt信号通路可恢复转移潜能的丧失（图7A）。MSAB（10μM）对Wnt信号通路的药理抑制显著抑制了SW620细胞的肿瘤球形成和干性相关因子NANOG和OCT4的表达（图7B-C）。MSAB处理也抑制SW620细胞的迁移和侵袭能力（图7D）。更重要的是，MSAB治疗阻断了BACE1-AS过表达细胞的肿瘤球形成和迁移和侵袭能力（图7E-F）。体内实验表明，MSAB处理（20mg/kg）抑制BACE1-AS过表达促进体内CRC肝转移（图7G）。

        综上所述，这些结果表明Wnt信号通路的激活在BACE1-AS促进肝转移中是至关重要的。在体外和体内实验中，抑制Wnt信号通路可以抑制BACE1-AS促进的结直肠癌干性和肝转移。

图7 药物抑制Wnt信号通路可抑制BACE1-AS促进的结直肠癌干性和肝转移

8. BACE1-AS通过靶向miR-214-3p增强TUFT1的表达

        由于研究者发现BACE1-AS通过TUFT1促进结直肠癌细胞的肝转移，并且预测了潜在的ceRNA网络，研究者接下来尝试建立BACE1-AS和TUFT1之间的ceRNA网络。ENCORI数据库预测BACE1-AS和TUFT1中均有miR-214-3p结合位点（图8A）。BACE1-AS敲除显著增加了miR-214-3p的表达（图8B）。相反，miR-214-3p模拟物抑制BACE1-AS的表达（图8C）。RIP实验显示，与IgG颗粒相比，Ago2抗体免疫沉淀显示SW620细胞的沉淀颗粒中BACE1-AS和miR-214-3p显著富集（图8D）。双荧光素酶报告实验检测BACE1-AS与miR-214-3p的直接相互作用。与RIP实验一致，研究者发现miR-214-3p mimics显著抑制BACE1-AS-WT组的荧光素酶活性，但不改变结合位点突变组的荧光素酶活性（图8E）。

        接下来，研究者检测BACE1-AS是否通过miR-214-3p调控TUFT1的表达。过表达miR-214-3p抑制TUFT1的表达（图8F）。荧光素酶报告实验表明，miR-214-3p mimics显著降低了TUFT1-WT的荧光素酶活性，但在结合位点突变组中并没有改变荧光素酶活性（图8G）。在BACE1-AS敲除细胞中，miR-214-3p抑制剂可以挽救TUFT1的表达（图8H）。此外，过表达BACE1-AS诱导的miR-214-3p可以逆转共转染TUFT1上调mimics（图8I）。同样，荧光素酶报告实验也显示出类似的改变。miR-214-3p mimics消除了TUFT1-WT组中BACE1-AS过表达对荧光素酶活性的促进作用（图8J）。这些结果表明BACE1-AS通过吸附miR-214-3p促进TUFT1的表达。

图8 BACE1-AS通过靶向miR-214-3p增强TUFT1的表达

实验方法：

        细胞培养，慢病毒感染，RNA分离和qRT-PCR，免疫印迹，原位杂交（ISH），RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）测定，伤口愈合试验，跨孔检测，肿瘤球形成试验，体内肝转移形成实验，双荧光素酶报告基因检测

参考文献：

        Wang X, Liu Y, Zhou M, Yu L, Si Z. m6A modified BACE1-AS contributes to liver metastasis and stemness-like properties in colorectal cancer through TUFT1 dependent activation of Wnt signaling. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Nov 21;42(1):306. doi: 10.1186/s13046-023-02881-0.