lncRNA GM15416-骨质疏松症治疗的新靶点

        骨质疏松症(Osteoporosis, OP)是一种常见的全身性骨疾病，成骨细胞的程序性死亡与骨质疏松症的发生发展密切相关。已有研究表明，c-fos可引起成骨细胞凋亡。此外，lncRNA在调节成骨细胞的生物学中起着普遍的作用。然而，lncRNA在成骨细胞死亡中与c-Fos相关的转录水平的确切作用和机制仍不确定。与正常成骨细胞相比，血清剥夺导致成骨细胞中转录因子c-Fos和凋亡相关Fas蛋白显著上调。此外，与c-Fos相关的lncRNA GM15416表达显著升高。c-Fos过表达导致下游Fas蛋白增加，进而导致成骨细胞凋亡，阻碍成骨。lncRNA GM15416表达减少导致c-Fos/Fas表达减少，从而阻碍成骨细胞凋亡，促进成骨。我们的研究结果表明lncRNA GM15416对成骨细胞凋亡具有抑制作用，是骨质疏松症的预防因子。因此，GM15416成为与骨质疏松症相关的重要lncRNA，并有望成为未来的治疗靶点。本文于2023年11月发表于“International Journal of Biological Macromolecules”（IF=8.2）上。

技术路线：

结果：

1）成骨细胞凋亡促进骨质疏松

        为了研究细胞凋亡在骨质疏松症中的作用，我们使用了Sham和OVX小鼠两种动物模型。我们通过micro-CT和H&E染色的初步评估显示，与假手术组相比，OVX组显示骨小梁减少，脂肪细胞增加(图1A、1B、1C)。OVX组中ARS和Von Kossa的表达水平显著降低(图1D, 1E)。Western blot验证显示，OVX组Bax水平显著升高，Bcl2水平显著降低。另一个关键的凋亡分子-caspase-3的水平显著升高(图1F, 1G)。为了促进体外成骨细胞凋亡模型的建立，我们在先前研究的基础上采用了血清饥饿诱导模型。值得注意的是，诱导组细胞凋亡水平明显升高。Bcl2表达降低，Bax、caspase-3、cleaved - caspase-3表达显著升高(图1H、图1I)。

2）c-fos和Fas的升高与成骨细胞凋亡显著相关

        为了建立c-Fos与骨质疏松之间更强的关联，我们特意选择了已被证实的凋亡关键分子Fas，并对Sham和OVX组进行了western blot分析。研究结果显示，OVX组中c-Fos和Fas蛋白水平显著增加(图2A, 2B)。同样，在体外实验，观察到SD组c-Fos和Fas蛋白水平显著升高(图2C, 2D)。随后，我们进行了co-IP实验来验证c-Fos和Fas在MC3T3-E1细胞中的存在，从而表明两者之间存在内在的相关性(图2E)。在c-Fos敲除后，免疫荧光分析显示，与NC组相比，si-Fos组的c-Fos荧光强度显著降低(图2F和2G)。si-Fos的体外验证表明，Fos表达的减少与Fas水平的降低相对应，因此，这导致凋亡相关蛋白Bax和cleaved caspase-3的抑制以及Bcl2水平的部分恢复(图2H-2I)。此外，敲除c-Fos后，细胞凋亡显著减少(图3A-3D)。以上结果表明，c-Fos通过作用于Fas诱导成骨细胞凋亡。

3）lncRNA GM15416在OVX小鼠和血清饥饿诱导的成骨细胞中高表达

        为了建立上述c-Fos基因之间的联系，我们进行了生物信息学和数据库比较的综合分析，鉴定出15个与c-Fos相关的差异表达lncRNA。此外，对GM15416进行GSEA富集分析，以确定其参与凋亡途径(图3E-3G)。体内和体外实验验证结果显示，血清饥饿诱导的成骨细胞中lncRNA GM15416的表达水平显著升高(图3H)。此外，OVX模型中GM15416的表达水平显著超过其他14种lncRNA的表达水平(图3I)。此外，我们评估了GM15416在OVX小鼠的7个器官中的表达水平，其中骨中GM15416的表达水平第二高(图3J)。

4）GM15416通过c-fos/fas轴促进成骨细胞凋亡，导致成骨分化能力降低

        我们将通过分子对接和分子动力学模拟实验来模拟lncRNA GM15416与c-Fos之间的关系。利用PyMOL，我们发现了蛋白与核酸CCCATCTGTCTTTCTGC之间的相互作用。在这些作用力的作用下，确定fos-核酸的得分为−291.81，表现出较好的性能(图4A)。通过动态模拟，我们可以得出蛋白质和核酸在原有的结合构象上进行了优化，使得复合物的结合更加稳定(图4B-4E)。此外，GM15416在细胞核内具有显著的丰度(图4F)。western blot分析表明，GM15416的体外下调导致c-Fos和Fas的表达水平降低，从而导致成骨细胞凋亡减少(图4G, 4H)。抑制GM15416可显著减少细胞凋亡(图4I-4L)。

        为了研究c-Fos对GM15416的影响，我们进行了RIP实验，发现c-Fos能够拉下GM15416(图5A)。此外，RNA下拉证实了相互作用，揭示生物素化的GM15416可以拉下c-Fos(图5B)。TUNEL染色和流式细胞术结果显示，GM15416过表达与成骨细胞凋亡增加有关。si-Fos的引入可以部分减轻GM15416诱导的细胞凋亡(图5C-5F)。western blot分析显示，GM15416过表达导致c-Fos和Fas表达水平上调，随后导致细胞凋亡水平升高。Fos敲低后，凋亡蛋白Bax、caspase-3和cleaved-caspase-3的表达水平下调(图5G, H)。免疫荧光染色分析显示GM15416过表达后c-Fos的相对荧光表达增加(图5I, J)。为了确定GM15416在成骨分化过程中的作用，我们使用western blot分析评估了成骨分化基因Runx2、Opn和Osx的蛋白表达水平(图5K, L)。结果显示，GM15416过表达导致的成骨分化异常可以通过抑制c-Fos得到改善。ALP和ARS的染色数据表明，GM15416对成骨分化能力有负面影响，可通过抑制c-Fos部分恢复成骨分化能力(图5M-5P)。这些实验结果表明，GM15416可通过上调c-Fos和Fas诱导成骨细胞凋亡，导致成骨分化受损。

5）抑制GM15416可挽救c-Fos介导的成骨细胞凋亡和成骨分化功能障碍

        为了研究GM15416对c-Fos的影响，采用了c-Fos和敲除GM15416的共培养。TUNEL染色和流式细胞术结果显示，GM15416敲低可有效减轻c-Fos过表达诱导的细胞凋亡(图6A-6D)。通过免疫荧光染色和western blot分析初步证实c-Fos成功过表达。随后，在功能验证阶段观察到c-Fos过表达。随着Fas表达的增加，凋亡诱导蛋白Bax、caspase-3、cleaved-caspase-3的表达水平升高，Bcl2的表达水平降低。然而，与c-Fos过表达组相比，共培养组显示出更高的细胞凋亡表达水平(图6E-6H)。随后，通过western blot分析评估成骨分化能力，研究GM15416基因敲低对成骨分化的影响。数据显示，c-Fos过表达导致成骨分化能力降低，而GM15416的敲低部分减轻了上述损伤(图6I, J)。应用ALP和ARS染色技术评估成骨矿化能力表明，c-Fos的上调会影响成骨矿化，而GM15416的下调会增强成骨矿化(见图6K-6N)。这些发现证明GM15416抑制可通过调节c-Fos和Fas的表达水平，减轻成骨细胞凋亡，增强成骨分化功能。

6）LncRNA GM15416减轻OVX小鼠骨丢失

        我们评估了GM15416在体内减轻骨质流失的治疗潜力。与OVX + si-NC组相比，OVX + si-GM15416组的骨矿物质密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)和小梁数(Tb.N)水平明显较高，小梁间隙(Tb.Sp)水平较低(图7A, B)。此外，si-GM15416显著增加骨小梁体积，促进骨形成过程。H&E图像的组织学检查进一步证实了这些结果(图7C)。western blot结果显示，与OVX + si-NC组相比，si-GM15416组对细胞凋亡有明显的抑制作用。此外，在OVX + si-GM15416组中，Fos和Fas蛋白各自的表达水平下调(图7D, E)。此外，小鼠股骨的免疫组织化学图像(图7F)显示，OVX + si-GM15416组与OVX + si-NC组相比，Runx2、Osx和Opn的表达水平更高。相反，OVX + si-GM15416组Fos、Fas、Bax、cleaved-caspase-3、Caspase-3的表达降低。western blot分析结果还显示，与对照组相比，GM15416敲低后成骨分化标志物Runx2、Osx、Opn的表达均有显著改善(图7G, H)。此外， si- GM15416组ARS和Von Kossa的相对表达水平显著高于si-NC组(图7I, J)。综上所述，上述研究结果证实了GM15416通过c-Fos/Fas途径诱导成骨细胞凋亡，最终导致骨质流失，如图7K所示。

结论：本研究提示lncRNA GM15416通过特异性影响c-Fos/Fas通路，对成骨细胞凋亡具有抑制作用，并可作为预防骨质疏松的因子。因此，GM15416成为与骨质疏松症相关的重要lncRNA，并有望成为未来的治疗靶点。

实验方法：OVX动物模型的建立，qPCR，Micro-CT，HE染色，免疫组化，免疫荧光，茜素红染色，碱性磷酸酶染色，Masson染色，Von Kossa染色，流式，TUNEL染色，WB，FISH，RIP，RNA pull down，Co-IP，分子对接。

参考文献：Zhao D, He J, Zhao X, Sheng X, Feng Z, Wang X, Zhang C, Wang S, Geng B, Xia Y. A novel lncRNA GM15416 regulates osteoblast apoptosis and differentiation through the c-Fos/Fas axis and mitigates osteoporosis. Int J Biol Macromol. 2023 Nov 2;254(Pt 2):127824. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2023.127824.