乳腺癌的Notch转录组标记的鉴定

失调的Notch信号是乳腺癌发生和发展的原因之一，但目前还缺乏有效的工具来测量乳腺癌亚型中的Notch信号水平以及对全身治疗的反应。有必要建立 Notch 信号的转录组特征，例如用于监测未来 Notch 靶向疗法的效果，以及了解 Notch 信号的改变是否是当前乳腺癌疗法的脱靶效应。在本报告中，作者选出了一个最佳的 20 个基因转录组特征。在两个独立的患者数据集（METABRIC 和 Oslo2）上对该特征进行了验证，与之前发表的特征相比，它的一致性得分和肿瘤特异性都有所提高。此外，基底样乳腺癌的特征得分特别高，表明这种亚型的 Notch 信号水平更高。在 PROMIX 和 BEAUTY 患者队列中，经过新辅助治疗后，特征得分有所提高，较低的特征得分通常与较好的临床预后相关。总之，本研究建立的20 个基因转录特征将成为评估未来乳腺癌 Notch 靶向疗法反应、了解传统乳腺癌疗法对 Notch 信号的潜在影响以及更好地对患者进行治疗分层的重要工具。本文于2024年1月发表在《Breast Cancer Research》IF:7.4期刊上。

技术路线：

主要实验结果：

1、一种鉴定Notch转录组特征候选基因的试验

为确定乳腺癌的Notch转录特征，首先确定了在乳腺癌背景下由Notch信号调节的基因。为此，对表达Notch信号的6个基底样乳腺癌细胞系中进行转录组测序。这些细胞系进行Notch信号激活（Jagged1诱导）和Notch信号阻断（DAPT诱导）处理，DMSO处理细胞作为“ground state”对照（图1B）。在激活/抑制后8和72小时，对6个细胞系进行转录组分析，以捕获由Notch调节引起的即时以及更长期的基因表达差异（图1B）。抑制或阻断效率通过qPCR检测经典Notch靶基因HES1和NRARP的表达验证。结果显示在分析的6个细胞系中，在8和/或72 h后，每个细胞系中至少有一个已建立的Notch靶基因HES1和NRARP出现预期的上调和下调（图1C），表明实验有效。在转录组数据的PCA中，细胞系彼此明显聚集， Notch信号的激活或阻断并没有重置整个转录组景观，而是诱导了更微妙的差异（图1D）。因此，变异的主要来源是细胞系之间的转录组差异，其次是处理时间，而Notch调节的影响较小，与主成分6、7和10显著相关，分别占数据集中总方差的3.5%、2.1%和0.5%（图1E）。总之，作者已经建立了一种检测方法，能够识别基底样乳腺癌细胞系中Notch诱导的转录组差异，并建立Notch标记的候选基因。

图1 在基底样乳腺癌细胞系中鉴定Notch调节基因的试验

2、鉴定一个强大和连贯的20个基因转录组的Notch信号

利用Notch信号在8h和72h时间点的激活或阻断数据集，在6个细胞系的所有可能条件和时间点之间搜索差异表达基因（DEGs）。由于Notch信号会导致下游基因表达的增加和减少，作者考虑不同实验点由上调或下调基因组成的DEG和潜在特征。在74个可能的比较中，作者只考虑了左偏P值分布和至少100个的DEGs的差异表达结果（图2A），从而选择了14个比较结果（图2B）。

为确定最佳特征长度，作者计算了TCGA-BRCA患者队列中候选比较中每个数目的基因的平均基因-基因相关性（一致性评分），作为训练队列。在10 ~ 30个基因的范围内，根据最大的一致性评分和最小的经验P值来选择每个特征中的最优基因数。该分析揭示了一致性评分> 0.2的三个特征：特征#5（15个基因）；特征#9：（17个基因）和特征# 11（20个基因）（图2C）。选取这三个特征进行进一步分析。为进一步探索这三个特征的准确性和稳健性，作者使用如上所述的相同的实验生成了一个新的转录组数据集，用于激活(Jagged1)和阻断(DAPT) Notch信号，但这次来自19个乳腺癌细胞系，包括10个基底样细胞系，三个来自Luminal A的细胞系，和6个HER2富集的乳腺癌细胞系（图2D）。来自19个处于基态（即没有Notch信号干扰）的细胞系的转录组显示，在PCA分析中，基底样、Luminal A和her2富集细胞系根据肿瘤亚型明显聚集（图2E）。 对于6种基底样细胞系的转录组分析(图1D)，与细胞系特异性差异相比，Notch信号升高或降低诱导的转录组差异较小（图2E）。接下来，使用GSEA和ROC曲线分析来测试这三个特征在19个细胞系转录组上的表现。特征#11来自Notch打开和Notch关闭的8h和72h时间点的上调DEG的交集，在三种不同条件下的GSEA分析中，它们的表现始终优于特征#5和#9（图2F）。总的来说，基于TCGA-BRCA患者数据集和独立Notch信号调制细胞系数据集的训练数据的特征#11表现出最好的性能，因此被用于随后的分析。

图2 20个基因Notch转录组特征的鉴定

3、20个基因转录组Notch信号的性质

选择的转录组特征#11按顺序包括以下20个基因：SEMA5B、NRARP、PLAT、PRELP、HEYL、FAT2、HEY1、KRT5、NPR3、KRT14、FLT1、RHOV、TNFRSF19、JAG1、MT1X、HEY2、PDGFRB、ZNF469、VSNL1和KIT（图3A）。所有20个基因都含有至少一个CSL结合位点，位于启动子区域，定义为转录起始位点(TSS)上游的3000 bp和下游的500 bp（图3B），其中17个基因（SEMA5B, NRARP, PRELP, HEYL, FAT2, HEY1, KRT5, NPR3, KRT14, FLT1, RHOV, TNFRSF19, JAG1, MT1X, HEY2, PDGFRB和ZNF469）先前已在ChIP-seq中使用来自不同模型的细胞系确定为CSL靶点。当这些基因被绘制在一个KEGG图网络中时，标记中的一些基因(JAG1, HEY1, HEY2和HEYL)与“乳腺癌”一词相关，而同样的四个基因加上PDGFRB和KIT与“癌症途径”一词相关（图3C）。总之，数据表明Notch信号中的20个基因可能代表Notch的直接下游基因，其中一些基因与不同的疾病相关，如乳腺癌或通路富集分析中的Notch。

图3 20个基因的Notch转录组特征

4、将20个基因的Notch转录组特征与先前建立的特征进行比较

通过计算一致性得分以及经验P值来估计已发表特征的质量。在 TCGA-BRCA、METABRIC 和 Oslo2 数据集中，57 个已分析的已发表特征中，分别有 9 个、4 个和 7 个特征的一致性得分大于 0.12。在 TCGA、METABRIC 和 Oslo2 数据集中，分别有 10 个、9 个和 6 个特征的调整后经验p值小于 0.0001。Vilimas等人的 "NOTCH1靶向下 "特征显示出比20个基因特征更高的一致性得分（TCGA-BRCA = 0.28，METABRIC = 0.19和Oslo2 = 0.22）（图4A）。一个重要的问题是，肿瘤纯度、基质和免疫浸润是否会对各种基因特征的性质产生影响。为解决这个问题，使用ESTIMATE方法推断了免疫和基质含量。包括本文报告的 20 个基因特征在内的大多数特征与 Immunescore 或 Stromalscore 没有明显的相关性，但 Vilimas 等人和 Klinakis 等人的特征与免疫浸润高度相关，而其他两个特征则与所有测试患者队列中的基质含量相关（图4B）。总之，本文的20个基因特征在所有测试和验证步骤中得分都很好，并且在大多数情况下优于先前描述的特征。

图4 将20基因特征与先前建立的Notch签名进行比较

5、20个基因特征在基底样乳腺癌细胞系和患者数据集中显示出更高的评分

在患者和细胞系数据集中验证了 20 个基因特征的一致性得分后，接下来利用该特征来了解不同的乳腺癌亚型是否具有不同水平的 Notch 信号。首先重新研究了代表基底样、Luminal A 和 HER2 富集亚型的 19 个细胞系的转录组分析。在基底样细胞系中，基底状态下的绝对特征得分明显更高（图5A），在基底样细胞系中，比较 "Notch开启"和 "Notch关闭"条件下与ground state状态下的相对特征得分差异显著（图5B）。此外，与ground state特征得分相比，相对特征得分在 "Notch开启"条件下增加，而在 "Notch关闭"条件下减少（图5C）。接下来，研究了三个患者数据集中 20 个基因特征的特征得分与 PAM50 分子亚型分类的关系。在 TCGA、METABRIC 和 Oslo2 数据集中，基底样/TNBC 和正常型乳腺癌的平均特征得分最高，其次是 Luminal A 亚型，HER2 和 Luminal B 亚型的特征得分较低（图5D）。总之，结果显示基底样亚型的特征得分较高。

图5 不同亚型乳腺癌中20个基因特征的特征评分

6、利用PROMIX和BEAUTY队列分析20个基因特征的乳腺癌治疗反应

为深入了解 Notch 信号水平是如何随着乳腺癌治疗反应和治疗结果而改变的，作者首先分析了 PROMIX 试验的数据。在接受两个周期的表柔比星和多西他赛治疗后，有放射学证据显示有残留疾病的患者子集中，有配对活检供转录组学分析，TNBC 患者组的特征得分（ssGSEA）在治疗后增加（图6A），Luminal B组有一定程度的升高，而Luminal A患者组无升高。此外，TNBC 患者的 Notch 特征基线（即治疗开始前）最高（图6A），这与图5中的结果一致。基线Notch特征得分较低的患者比Notch特征得分较高的患者显示出更好的无病生存期（DFS）趋势（图6B），Notch核心特征也是如此。与没有淋巴结转移的患者相比，有淋巴结转移的患者在治疗前原发肿瘤的特征得分较低（图6C）。

图6 PROMIX乳腺癌队列中20个基因标记评分分析

接下来，研究了前瞻性乳腺癌基因组指导治疗研究（BEAUTY）中Notch信号对治疗的响应水平。通过GSVA评估，基线 TNBC 亚型的 20 个基因特征得分最高，其次是 Luminal A、HER2 + 和 Luminal B 亚型（图7A）。比较基线和手术时的 GSVA，HER2+、Luminal A 和 Luminal B 患者的 GSVA 值增加，而 TNBC 组的 GSVA 值减少（图7B）。在分析 TNBC 组治疗应答者与非应答者治疗前的 GSVA 特征评分时，非应答者组在治疗开始前的 GSVA 值更高（图7C）。

综合来看，PROMIX 和 BEAUTY 队列的数据表明，TNBC 肿瘤在治疗前的 Notch 信号水平较高，在某些情况下，化疗可能会诱导 Notch 信号的增加，尽管 TNBC 和 Luminal A 患者在这方面的结果在两个队列中有所不同。数据普遍表明，基线Notch信号的升高可能与预后有关，因为在PROMIX队列中，Notch信号的升高与较差的无病生存期有关。此外，在BEAUTY队列中，TNBC患者和NAC后残留疾病患者在治疗前肿瘤中的Notch信号得分较高。

图7 BEAUTY乳腺癌队列中20个基因特征评分分析

实验方法：

细胞培养，Notch信号的激活和阻断，qRT-PCR，RNA测序，生物信息学分析，TCGA BRCA队列中Notch突变状态的特征评分分析，PROMIX和BEAUTY患者的研究

参考文献：

Braune EB, Geist F, Tang X, Kalari K, Boughey J, Wang L, Leon-Ferre RA, D'Assoro AB, Ingle JN, Goetz MP, Kreis J, Wang K, Foukakis T, Seshire A, Wienke D, Lendahl U. Identification of a Notch transcriptomic signature for breast cancer. Breast Cancer Res. 2024 Jan 3;26(1):4. doi: 10.1186/s13058-023-01757-7.