巨噬细胞自噬通过降解TARM1抑制肾脏炎症从而预防急性肾损伤

肾小管上皮细胞中的大自噬/自噬激活可防止急性肾损伤（AKI）。然而，免疫细胞自噬（如涉及巨噬细胞的自噬）在AKI 中的作用仍不清楚。在这项研究中，作者发现巨噬细胞自噬是AKI 期间的一种适应性反应，因为在LPS 或单侧缺血再灌注诱导的AKI 期间，与WT 小鼠相比，巨噬细胞特异性自噬缺陷（atg5^-/-）小鼠表现出更高的血清肌酐、更严重的肾小管损伤、ADGRE1/F4/80+巨噬细胞浸润增加以及炎症因子表达升高。在氯膦酸脂质体诱导的巨噬细胞耗竭小鼠中，采用转移atg5^-/- 巨噬细胞（而非 WT 巨噬细胞）引起更严重的AKI 进一步证实这一点。在体外也得到类似的结果，即缺乏Atg5 的骨髓源巨噬细胞（BMDMs）对LPS 和IFNG 的反应在很大程度上增加促炎细胞因子的表达。机理上，Atg5基因缺失显著上调TARM1（髓样细胞上与T 细胞相互作用的活化受体1）的蛋白表达，而抑制TARM1 则抑制LPS 和IFNG 诱导的atg5^-/- RAW 264.7 巨噬细胞炎症反应。E3泛素连接酶MARCHF1和MARCHF8泛素化TARM1，并以自噬依赖的方式促进其降解，而沉默或突变MARCHF1和MARCHF8的功能域则取消TARM1的降解。此外，泛素化的TARM1 从质膜内化到内体，然后被泛素结合的自噬受体TAX1BP1 和SQSTM1 招募到自噬-溶酶体途径中降解。总之，巨噬细胞自噬可通过MARCHF1和MARCHF8介导的TARM1降解抑制肾脏炎症，从而预防AKI。该研究于2025年1月发表在《Autophagy》，IF：14.6。

作者首先研究了AKI患者和小鼠肾巨噬细胞中的自噬现象。单细胞转录组数据分析显示，在红外诱导的 AKI（IR-AKI）小鼠的肾巨噬细胞中，Atg5、Atg7、Atg12、Lc3、Sqstm1、Lamp1 和 Lamp2 等自噬基因的表达量比在假小鼠肾巨噬细胞中的表达量要高（图 1A）。免疫荧光分析显示，与极小变化肾病/MCN 患者相比，AKI 患者 CD68⁺ 巨噬细胞中 MAP1LC3/LC3（微管相关蛋白 1 轻链 3）的表达升高（图 1B）。这些数据表明，自噬是 AKI 期间肾巨噬细胞的一种适应性反应。

为监测自噬通量，构建巨噬细胞特异性串联标记的mCherry-EGFP-LC3转基因小鼠，当游离自噬体与溶酶体因酸性而融合时，游离自噬体中的黄色荧光颗粒（mCherry-EGFP-LC3）会变成红色荧光（mCherry-LC3），从而实现巨噬细胞中自噬体动态的可视化。免疫荧光分析显示，与对照组小鼠相比，IR-AKI 和脂多糖（LPS）诱导的败血症相关性 AKI（SA-AKI）小鼠肾脏 ADGRE1/F4/80⁺ 巨噬细胞数量增加，自噬体（黄色点）和自溶酶体（仅红色点）增加（图 1C、D）。这些数据表明，在 AKI 进展过程中，肾巨噬细胞中的自噬被激活。

为研究巨噬细胞自噬在AKI中的作用，将Lyz2（溶菌酶2）-Cre与Atg5^flox/+小鼠杂交，产生巨噬细胞自噬缺陷小鼠（atg5^-/-小鼠）和Atg5flox/flox（WT）对照小鼠。如图 2A 所示，LPS（5 毫克/千克）处理后 12 小时，atg5^-/- 小鼠的死亡率为 50%，36 小时后增至 100%。相反，WT 小鼠表现出对 LPS 的抵抗力，在整个实验期间死亡率仅为五分之一。因此，将 LPS 的剂量降至 1 mg/kg（体重），以防止 atg5^-/- 小鼠死亡。与WT小鼠相比，atg5^-/-小鼠的血清肌酐（Scr）水平升高（图2B）。此外，肾脏的病理损伤加剧，与WT小鼠相比，Atg5^-/-小鼠肾小管损伤的标志物HAVCR1/KIM-1上调（图2C-F）。因此，与WT小鼠相比，atg5^-/-小鼠发生更严重的SA-AKI。这些发现在IR-AKI中得到进一步证实。此外，与 WT 小鼠相比，atg5^-/- 小鼠的肾小管损伤更严重，HAVCR1 表达更高（图 2G-J）。总之，这些结果说明巨噬细胞自噬可保护小鼠免受 LPS 和 IR 诱导的 AKI 的影响。

如图 3A 和 B 所示，与患有 SA-AKI 的 WT 小鼠相比，atg5^-/- 小鼠肾组织中的 ADGRE1+ 巨噬细胞更为明显。此外，在SA-AKI期间，与WT小鼠相比，atg5^-/-小鼠肾脏炎症因子（包括CCL2/MCP-1、NLRP3和IL18）的表达明显上调（图3C、D）。与SA-AKI中的情况一样，巨噬细胞中Atg5的缺失也会明显增强ADGRE1+巨噬细胞的浸润（图3E、F）和atg5^-/-小鼠肾脏炎症细胞因子的产生（图3G、H）。体外研究也证实类似的结果，体外研究显示，与WT BMDMs相比，LPS和IFNG刺激显著增加atg5^-/-BMDMs中NOS2、NLRP3和IL18的蛋白水平（图3I、J）。这些结果表明，巨噬细胞自噬可抑制 AKI 中的肾脏炎症。

在Lyz2-Cre下缺失Atg5不仅会破坏巨噬细胞的自噬，还会破坏中性粒细胞系的自噬，而中性粒细胞系也会导致AKI中的肾脏炎症。为排除这种可能性，接下来利用过继转移实验检验自噬是否能通过抑制巨噬细胞介导的炎症反应来减轻 AKI（图 4A）。克罗膦酸脂质体诱导的巨噬细胞消耗保护了SA-AKI 小鼠的肾损伤和炎症反应（图 4B-D、J），证明巨噬细胞是驱动 AKI 的关键免疫细胞成分。此外，与 WT RAW 264.7 巨噬细胞相反，在接受 SA-AKI 的巨噬细胞缺失 WT 小鼠中，采纳转移 atg5^-/- RAW 264.7 巨噬细胞会明显损害肾功能并加剧肾小管损伤（图 4B-D）。同样，与向巨噬细胞耗竭的 WT 或 atg5^-/-小鼠移入 WT BMDMs 相比，移入 atg5^-/- BMDMs 会显著加重肾小管病变、上调 HAVCR1 表达和升高血清肌酐（图 4E-I）。此外，与接受 WT 巨噬细胞的小鼠相比，自噬缺陷巨噬细胞的过继转移明显增加巨噬细胞耗竭 WT 小鼠肾脏中这些炎症分子的水平（图 4J、K）。这些结果进一步证实，自噬缺陷的巨噬细胞是导致 AKI 中肾小管过度损伤和肾脏炎症的罪魁祸首。

为探索自噬抑制巨噬细胞促炎活性的机制，对受到LPS和IFNG刺激的WT小鼠和atg5^-/-小鼠的BMDMs进行了蛋白质组学分析。结果显示，分别有15个和10个蛋白质被显著上调和下调（|log2 fold|>2，p < 0.05）（图5A）。其中，新发现的白细胞免疫球蛋白样受体家族成员TARM1与WT BMDMs相比，在LPS和IFNG处理后在atg5^-/-BMDMs中明显上调（图5B，C）。此外，在 SA-AKI 期间，与 WT 小鼠相比，atg5^-/- 小鼠肾组织中的 TARM1 也明显上调（图 5D、E）。有趣的是，通过 siRNA 或固定竞争性 TARM1-FC 融合蛋白抑制 TARM1 能显著抑制 LPS- 和 IFNG 诱导的 Atg5 缺陷 RAW 264.7 巨噬细胞中 NOS2 或 IL18 的表达（图 5F-K）。这些结果表明，自噬缺陷诱导的TARM1通过SYK-NFKB信号通路激活促炎巨噬细胞。

自噬-溶酶体途径和蛋白酶体系统是细胞蛋白质降解的两个主要途径，这一点已得到公认。在本研究中，蛋白酶体抑制剂 MG132 处理 BMDMs 不会改变 TARM1 的表达（图 6C，D）。相反，自噬激活剂 Rap 或 torin1 诱导的自噬下调 BMDMs 中 TARM1 的表达；然而，CQ 或巴佛洛霉素 A1（Baf）抑制自噬增加 TARM1 的水平（图 6E，F），这表明巨噬细胞 TARM1 是通过自噬-溶酶体途径而不是蛋白酶体途径降解的。

以前的研究表明，细胞膜受体在泛素化后被转运到内体，然后被分类到溶酶体降解。然而，最近的研究表明，自噬参与膜受体的降解。在这里，作者发现，通过删除 Atg5 或用自噬抑制剂沃特曼宁（Wortmannin）和 LY294002 处理来抑制自噬体的形成，导致 TARM1 在 RAW 264.7 巨噬细胞中积累。同时抑制自噬体的形成和溶酶体的功能并不会导致 TARM1 表达的进一步上调（图 6G-J），这表明自噬体和溶酶体以相同的途径降解巨噬细胞中的 TARM1。

泛素化是蛋白质降解不可或缺的步骤。假设巨噬细胞的 TARM1 首先被 E3 泛素连接酶泛素化，如图 7A 所述内化到内体，被 LC3 阳性的自噬体吞噬进入溶酶体降解。为解决这些假设，首先探讨哪种 E3 泛素连接酶介导 TARM1 泛素化，这是 TARM1 被自噬受体识别并转运至自噬-溶酶体降解的关键修饰。利用在线工具 UbiBrowser 2.0 (http://ubibrowser.bio-it.cn/ubibrowser_v3/home/index)预测在人类和小鼠中保守的 E3 泛素连接酶 MARCHF1、MARCHF8 和 SYTL4 可介导 TARM1 泛素化（图 7B）。用 TARM1-Flag 和空载体或 MARCHF1-MYC、MARCHF8-MYC 或 SYTL4-MYC 质粒共转染 HEK293T 细胞。强制表达 MARCHF1 或 MARCHF8 以剂量依赖的方式降解 TARM1，而 SYTL4 的过表达不改变 TARM1 的水平（图 7C）。进一步的研究发现，CQ抑制MARCHF1和MARCHF8诱导的TARM1降解，而蛋白酶体抑制剂MG132没有抑制这种降解（图7D），这支持MARCHF1和MARCHF8通过自噬而不是蛋白酶体介导的蛋白水解诱导TARM1降解。此外，共免疫沉淀实验进一步表明，MARCHF1 和 MARCHF8 与 TARM1 相互作用并促进其泛素化（图 7E、F）。与此相反，当 MARCHF1 和 MARCHF8 的功能域发生突变时，它们在 TARM1 泛素化和降解中的功能丧失（图 7G）。

最后，用shRNA 沉默MARCHF1 和MARCHF8 增加RAW 264.7 巨噬细胞中TARM1 的表达，同时增加NOS2 和IL18 的水平（图8A-D）。相反，过表达MARCHF1 和MARCHF8 抑制TARM1，从而降低巨噬细胞中NOS2 和IL18 的水平（图8E-H）。总之，这些结果表明，MARCHF1和MARCHF8 促进自噬介导的TARM1 降解，从而抑制巨噬细胞的炎症反应。

接下来，作者探讨了泛素化是否是 TARM1 内吞所必需的。 TARM1 的细胞质结构域包含两个保守的赖氨酸残基 K286 和 K293，它们是潜在的泛素化位点。因此，用精氨酸取代这两个赖氨酸残基，结果发现 MARCHF1 和 MARCHF8 不能促进突变 TARM1 的泛素化和降解（图 9A）。免疫荧光结果进一步表明，TARM1 在 RAW 264.7 巨噬细胞的细胞膜上表达。然而，在 LPS 和 IFNG 的刺激下，K-to-R 突变的 TARM1 无法从质膜内化到内体（图 9B）。所有这些结果表明，TARM1泛素化是其内吞不可或缺的条件。随后，在 LPS 和 IFNG 的刺激下，转染 TARM1[Mut]-His 的巨噬细胞与转染WT TARM1 的巨噬细胞相比，NOS2、NLRP3 和 IL18 的表达量显著增加（图 9C，D）。值得注意的是，这些数据强调了表面-TARM1 而不是细胞质-TARM1 在介导巨噬细胞炎症中的关键作用。

公认的选择性自噬受体，如 SQSTM1、NBR1、OPTN（optineurin）、CALCOCO2/NDP52 和 TAX1BP1，可通过 LC3 结合区/LIR 结构域和 PB1 结构域将底物转移至自噬体和溶酶体。通过共免疫沉淀分析，TARM1 可与 TAX1BP1、SQSTM1 和 NBR1 相互作用（图 10A），表明 TARM1 可被这些选择性受体识别。此外，细胞免疫荧光数据显示，LPS 和 IFNG 处理会引发 TARM1 在细胞质中聚集，并与转染 TARM1-Flag 的 RAW 264.7 巨噬细胞中的选择性自噬受体 TAX1BP1、SQSTM1 和 NBR1 共定位（图 10B-E）。此外，在 RAW 264.7 巨噬细胞中，LPS 和 IFNG 也诱导 TARM1 与 LC3 共定位。然而，与阴性对照（NC）相比，通过 shRNA 沉默 TAX1BP1 或 SQSTM1 会减少 LPS 和 IFNG 刺激后 TARM1 与 LC3 的共定位，而沉默 NBR1 的影响较小（图 10F-J）。此外，Atg5的缺失也显著增加TAX1BP1和SQSTM1的表达，表明TAX1BP1和SQSTM1可能是巨噬细胞中TARM1的主要受体（图5A）。此外，如图 10K 所示，自噬受体 TAX1BP1 和 SQSTM1 与泛素化 TARM1 的亲和分离分析表明，泛素化 TARM1 与自噬受体 TAX1BP1 和 SQSTM1 结合。这些结果表明，泛素化的 TARM1 内化为内体，随后被细胞质中的自噬受体 TAX1BP1 和 SQSTM1 识别，然后被 LC3 阳性吞噬细胞吞噬并与溶酶体融合降解。

综上所述，本研究发现巨噬细胞自噬是对 AKI 的一种适应性反应。在 AKI 小鼠模型中，巨噬细胞自噬功能缺失的小鼠表现出更严重的肾损伤和炎症。巨噬细胞中缺乏自噬相关基因 Atg5 导致促炎症细胞因子的高表达。此外，巨噬细胞中缺失 Atg5 增加 TARM1 蛋白，而 TARM1 蛋白受 E3 泛素连接酶 MARCHF1 和 MARCHF8 的调控，促进其通过自噬降解。这一过程涉及 TARM1 的内化和被 SQSTM1 和 TAX1BP1 等自噬受体招募到溶酶体（图 11）。总之，巨噬细胞自噬可通过降解 TARM1 减少炎症反应，从而缓解 AKI，为肾脏疾病的治疗提供新的靶点。

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Huang XR, Ye L, An N, Wu CY, Wu HL, Li HY, Huang YH, Ye QR, Liu MD, Yang LW, Liu JX, Tang JX, Pan QJ, Wang P, Sun L, Xia Y, Lan HY, Yang C, Liu HF. Macrophage autophagy protects against acute kidney injury by inhibiting renal inflammation through the degradation of TARM1. Autophagy. 2025 Jan;21(1):120-140. doi: 10.1080/15548627.2024.2393926. Epub 2024 Sep 8. PMID: 39193910; PMCID: PMC11702950.