MICAL2促进胰腺癌的生长和转移

胰腺导管腺癌（PDAC）是一种致命的恶性肿瘤，其特征是早期转移、对传统疗法的耐药性以及预后极差。尽管在理解PDAC的遗传学、识别转录亚型以及对其肿瘤微环境的深入了解方面取得了显著进展，但仍缺乏有效的治疗方法。目前该病的治疗主要依赖于传统的细胞毒性疗法，这种疗法易对患者产生不良影响。在本研究中，作者对PDAC的超级增强子（SE）景观进行了表征，以识别可能具有靶向性的疾病驱动因素。分析结果显示MICAL2作为PDAC超级增强子相关基因，能够编码黄素单加氧酶MICAL2，该酶诱导肌动蛋白解聚，并通过调节血清反应因子共激活因子（MRTF-A和MRTF-B）的可用性，间接促进SRF转录。MICAL2在PDAC中过表达，且高MICAL2表达与患者预后不良相关。转录分析显示，MICAL2上调KRAS和EMT信号通路，促进肿瘤生长和转移。在人和小鼠PDAC细胞中MICAL2功能丧失和获得实验中，作者发现MICAL2促进了ERK1/2和AKT的激活，并促进了体内肿瘤的生长和转移。有趣的是，作者还发现由MRTF-B而不是MRTF-A在体内模仿了MICAL2驱动的表型。总之，作者的这项研究突出了MICAL2影响PDAC的多种机制，并为未来研究靶向MICAL2的干预治疗提供了理论基础。该研究于2025年1月发表在《Cancer Research》，IF 14.2分。

作者从接受PDAC手术切除的患者中获取了肿瘤样本（n = 7），以及接受非腺癌组织切除的患者的正常胰腺组织样本（n = 6）。将这些组织样本进行裂解，并进行了组蛋白3赖氨酸27乙酰化（H3K27ac）的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq），以识别人类PDAC中的活跃转录区域。作者通过计算方法识别了正常和肿瘤样本中的超级增强子（SE）区域和SE相关基因（图1A）。在肿瘤样本中，富集程度最高的SE相关基因包括DAD1、MBP（与神经周围侵袭相关）；LIMK2、MSN、CAPZB（与细胞骨架动态相关）；FCGR3A、FCGR2A、RUNX1（与免疫调节相关）。正常胰腺组织中富集的SE相关基因包括CEL和PLA2G1B（与胰腺外分泌功能相关）。

接下来，作者试图识别在PDAC中上调的基因，这些基因编码的蛋白质有可能被小分子或抗体基础的治疗药物所靶向。与正常组织相比，MICAL2在肿瘤样本中显著富集（Log2变化倍数为1.07；调整后的p值为5.39×10^-4）（图1A）。此外，定量PCR（qPCR）分析显示，MICAL2 mRNA在肿瘤样本中富集（p值为0.009），这表明在启动子和编码区域增加的H3K27ac信号确实导致了MICAL2位点的转录激活增加（图1B、1C）。为了确定MICAL2转录水平的提高是否导致PDAC肿瘤中MICAL2蛋白水平的增加，作者对人类正常胰腺和PDAC组织进行了免疫组化（IHC）染色。作者发现在4例患者肿瘤中MICAL2染色呈现出显著的肿瘤特异性增加（图2A）。接下来，作者观察到在常用的KrasLSL-G12D；TP53LSL-R172H；以及PDX1-cre（KPC）基因工程小鼠模型中，高MICAL2蛋白水平和肿瘤特异性得以保持（图2B）。作者研究了MICAL2表达与接受手术切除的PDAC患者（PanCuRx）以及晚期疾病患者（COMPASS）的预后之间的关联。作者发现，在手术队列中，高MICAL2表达与更差的预后相关，但在晚期队列中并非预后因素（图2C-D）。这表明MICAL2可能在原发性到晚期疾病的进展中发挥作用。总体而言，作者发现PDAC具有与已知PDAC生物学相关的独特SE相关基因景观。作者在这些基因中发现了MICAL2，并确定与正常邻近组织相比，PDAC中的MICAL2转录水平更高，这在作者的研究以及其他独立数据集中都得到了证实，并且与蛋白水平的增加表达相关。重要的是，高MICAL2表达与手术切除肿瘤患者的预后不良相关，表明高表达MICAL2可能标记着复发和进展风险增加的肿瘤。

在上皮细胞中，作者发现MICAL2基因座上游存在416个假定的超级增强子（SE）区域。为了确定MICAL2转录水平的提高是否导致PDAC肿瘤中MICAL2蛋白水平的增加，作者对人类正常胰腺和PDAC组织进行了免疫组化（IHC）检测。在4例患者肿瘤中，MICAL2染色呈现出显著的肿瘤特异性增加（图2A）。

接下来，作者观察到在常用的KrasLSL-G12D，TP53LSL-R172H和PDX1-cre（KPC）基因工程小鼠模型中，高MICAL2蛋白水平和肿瘤特异性得以保留（图2B）。在手术队列中，高MICAL2表达与更差的预后相关，但在晚期队列中并不具有预后价值（图2C-D）。这表明MICAL2可能在原发疾病向晚期疾病进展中发挥作用。

总体而言，作者的数据表明PDAC具有与已知PDAC生物学相关的独特SE相关基因景观。作者在这些基因中发现了MICAL2，并确定与正常邻近组织相比，PDAC中MICAL2的转录水平更高，这在作者的研究以及其他独立数据集中均有所体现，并且与蛋白水平的增加表达相关。重要的是，高MICAL2表达与手术切除肿瘤患者的预后不良相关，表明高表达MICAL2可能标记着复发和进展风险增加的肿瘤。

作者发现，在MICAL2基因敲低（KD）细胞中，额外的促生存途径丧失，例如TNFα和HIF1α信号通路，这表明MICAL2可能在胰腺导管腺癌（PDAC）中作为原癌基因发挥作用。重要的是，作者发现EMT信号通路在MICAL2 KD细胞中也显著减少（图3A）。作者利用Der实验室最近发表的一项研究，该研究全面分析了KRAS依赖的转录程序，并发现沉默MICAL2后，KRAS调控的基因进一步下调，这表明MICAL2调节KRAS信号通路（图3B）。作为一种正交途径分析方法，作者通过OncoGPS方法识别了与MICAL2表达相关的细胞状态，这些细胞状态是通过KRAS激活的下游转录活性在癌症细胞系百科全书（CCLE）的其他肿瘤模型中阐明的。与GSEA类似，作者发现EMT状态与CCLE中更高的MICAL2基因表达相关（图3C）。为了进一步研究EMT表型，作者使用了一种源自KPC肝转移的PDAC类器官系KPC46，该类器官具有间充质特征和高转移倾向（图3D）。在MICAL2 KD细胞中，作者观察到间充质到上皮的转变，表现为高度均匀、极化、紧凑的上皮细胞结构，表达增加的E-钙粘蛋白（图3E）。总体而言，这些实验揭示了MICAL2在人类和小鼠PDAC模型中驱动MRTF/SRF转录、EMT和促癌途径。

作者的转录组分析表明，MICAL2缺失的PDAC细胞中KRAS信号通路发生了改变。因此，作者评估了在MICAL2功能丧失和获得的细胞中KRAS效应通路PI3K/AKT和MAPK/ERK信号的激活情况。由于MICAL2的缺失导致SRF共激活因子MRTF-A和MRTF-B的表达发生改变，作者还研究了这两个基因敲低（KD）的效果。在人类PDAC细胞系AsPC1中，MICAL2的缺失导致p-AKT显著减少，而p-ERK1/2没有变化（图3F）。负性细胞周期调节因子P27在MICAL2敲低细胞中显著增加，这表明MICAL2可能通过这种方式调节细胞增殖。通过siRNA介导的MRTF-B沉默模拟了MICAL2沉默细胞中观察到的p-AKT减少现象。有趣的是，MRTF-A的缺失并未重现这一表型，且MRTFs的功能丧失并未模拟P27的增加。

接下来，作者在KPC46细胞中评估了MICAL2和MRTFs的缺失。作者发现，小鼠PDAC细胞在MICAL2和MRTF-B沉默的细胞中重现了p-AKT和p-ERK1/2的减少，然而，这一细胞系中P27未发生变化（图3G）。这些结果表明，MICAL2和MRTF-B缺失的细胞中PI3K和MAPK的磷酸化减少，与KRAS信号减弱一致。当作者检查经过改造以表达MICAL2的BxPc3细胞时，作者发现p-AKT和P27的表达显著增加（图3H）。为了直接确定MICAL2表达是否改变了KRAS信号，作者在BxPc3细胞中过表达MICAL2后对KRAS-GTP装载进行了表征。作者发现这些细胞中KRAS-GTP装载水平显著增加，从而直接将MICAL2表达与KRAS活性联系起来（图3I）。

为了进一步评估MICAL2对KRAS信号通路的影响，作者考察了MICAL2基因敲低（KD）对巨胞饮作用的影响，这是一种由KRAS驱动的细胞外营养物质摄取过程。作者观察到MICAL2缺失细胞中巨胞饮作用显著减少，这与KRAS信号活性的降低一致（图3J）。综上所述，功能丧失和功能获得研究揭示了MICAL2通过KRAS促进信号传导，表现为KRAS-GTP结合、MAPK和PI3K的磷酸化以及巨胞饮作用。尽管存在模型间的差异，这些观察到的生化结果与作者对细胞转录组的通路分析一致。

作者为了探究MICAL2功能丧失和功能获得对PDAC细胞癌性表型的影响。鉴于MICAL2似乎驱动EMT过程，作者首先测量了MICAL2、MRTF-A和MRTF-B缺失细胞的运动能力。作者发现，在ASPC1和KPC46细胞中，MICAL2敲低（KD）后迁移能力均有所降低（图4A，B）。作者还发现，人类ASPC1细胞中MRTF-A和MRTF-B的敲低减少了细胞迁移，而在小鼠KPC46细胞中，仅MRTF-A的敲低导致迁移能力下降。相反，在功能获得实验中，过表达MICAL2的BxPc3细胞相比空载体对照细胞显示出增强的迁移能力（图4C）。

随后，作者评估了MICAL2对细胞增殖的影响。作者发现，MICAL2基因敲低（KD）导致ASPC1和KPC46细胞的增殖显著减少，而BxPc3细胞中MICAL2的过表达（OE）则使增殖率相较于对照细胞有所增加（图4D-F）。有趣的是，无论是人类还是小鼠的PDAC细胞中，任一MRTF的敲低仅导致细胞增殖率的部分下降（图4D-E）。为了更好地了解MICAL2表达影响细胞周期的哪一部分，作者使用流式细胞术来检测细胞周期进程。在ASPC1和KPC46细胞中，MICAL2和MRTF-B缺失的细胞显著倾向于G0/G1期的停滞，并且S期和G2/M期的细胞比例相应减少（图4G和H）。缺乏MRTF-A的KPC46细胞在细胞周期轮廓上没有变化，但缺乏MRTF-A的ASPC1细胞却意外地在S期出现阻滞，而非G0/G1期，这暗示了不同模型之间以及人类与小鼠PDAC细胞之间可能存在的差异。相反，过表达MICAL2的BxPc3细胞更快地通过G0/G1期，并且相较于对照组，S期的细胞比例增加，表明MICAL2表达的增加足以促进细胞分裂（图4I）。总体而言，这些实验表明MICAL2和MRTF-A/B的表达促进了细胞的迁移、侵袭和增殖。此外，这些发现与作者在PDAC细胞中基因敲低MICAL2后观察到的RNA测序和生化结果一致。

作者通过体外沉默MICAL2，观察到细胞增殖、迁移、侵袭减少，以及EMT表型的逆转。因此，作者接下来旨在确定MICAL2和MRTFs的缺失如何影响肿瘤形成，最初使用异位皮下小鼠移植模型。作者首先将具有MICAL2或MRTF-A/B组成性敲低的AsPC1细胞移植到免疫缺陷的NSG小鼠中。作者观察到，当MICAL2和MRTF-B缺失时，肿瘤大小显著减少，但MRTF-A沉默后没有显著差异（图5A）。在同种小鼠中移植KPC46细胞重现了人类PDAC细胞观察到的结果，尽管肿瘤形成减少更为显著（图5B）。在一个实验中，MICAL敲低细胞未形成肿瘤，而在重复实验中，6个中有1个肿瘤未形成，其余肿瘤相对于对照组显著生长抑制。相反，当注射到NSG动物的侧腹时，过表达MICAL2的BxPc3细胞比对照细胞生长得更大（图5C）。为了确定MICAL2敲低细胞生长减少是否由于植入失败，作者建立了用shRNA靶向MICAL2（ish-MICAL2）或对照（ish-control）的强力霉素（dox）诱导型KPC46细胞。作者将细胞植入同种动物的侧腹，并在强力霉素诱导前让肿瘤形成10天，通过触诊和超声波记录。在用强力霉素处理的ish-MICAL2植入小鼠中，与ish-control相比，44天内的肿瘤生长被抑制，但在未用强力霉素处理的常规饮食小鼠中则没有（图5D-E）。作者通过将细胞植入胰尾来研究MICAL2和MRTFs如何影响原位肿瘤生长。作者发现，只有植入AsPC1 MICAL2-KD细胞的小鼠，而非MRTF-KDs，有显著减少的肿瘤负荷，而在KPC46模型中，与scramble对照相比，MICAL2和MRTF-B沉默的细胞在体内生长减少（图5F-G）。总之，PDAC细胞中MICAL2和MRTF-B的表达促进了异位和原位的肿瘤生长，而MRTF-A的表达对肿瘤生长没有影响。这些结果与作者体外发现MICAL2促进PDAC细胞增殖的发现一致，并表明MRTF-A和-B在促进胰腺肿瘤生长中扮演不同的角色。

为了确定MICAL2和MRTFs表达如何影响PDAC细胞转移到肝脏的能力，作者将PDAC细胞注射到小鼠的脾脏中。作者首先注射了MICAL2、MRTF-A和MRTF-B敲低的KPC46细胞（图6A）。从宏观上看，作者观察到在MICAL2、MRTF-A和MRTF-B敲低模型中，肝脏转移负担显著减少，与对照细胞相比。从组织学上看，作者发现与对照细胞注射时广泛的转移性疾病相比，敲低模型中只有小的、通常仅在显微镜下可检测到的肝脏转移。为了确定dox诱导的MICAL2敲低细胞的植入是否导致这种表型，作者将ish-MICAL2或ish-对照KPC46细胞注射到同种小鼠的脾脏中，并在注射后第3天给小鼠提供dox。在这个模型中，作者发现ish-MICAL2组在宏观和组织学上的转移显著减少。最后，作者将过表达MICAL2或载体对照的BxPc3细胞注射到NSG小鼠的脾脏中。这些结果表明MICAL2、MRTF-A和B促进PDAC细胞的肝脏转移

综上所述，作者研究了PDAC的表观基因组图谱，识别出MICAL2作为一个独特的PDAC进展驱动因子，通过其对MRTF/SRF信号通路的调控。作者还确定了MRTF-A与MRTF-B在促进PDAC生长中的不同效应。鉴于MICAL2和MRTF-SRF生物学在调控其肿瘤生物学基本转录程序中的作用，它们代表了PDAC治疗中具有吸引力的、新的且可能易于处理的靶点。

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Garg B, Khan S, Courelli AS, Panneerpandian P, Sheik Pran Babu D, Mose ES, Gulay KCM, Sharma S, Sood D, Wenzel AT, Martsinkovskiy A, Rajbhandari N, Patel J, Jaquish D, Esparza E, Jaque K, Aggarwal N, Lambies G, D'Ippolito A, Austgen K, Johnston B, Orlando DA, Jang GH, Gallinger S, Goodfellow E, Brodt P, Commisso C, Tamayo P, Mesirov JP, Tiriac H, Lowy AM. MICAL2 Promotes Pancreatic Cancer Growth and Metastasis. Cancer Res. 2025 Jan 2. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-24-0744. Epub ahead of print. PMID: 39745352.