靶向Tau蛋白可以缓解地塞米松诱导的骨质疏松症

糖皮质激素（GCs）是一类广泛使用的抗炎和免疫抑制药物，但其长期使用会导致多种副作用，其中最常见的是糖皮质激素诱导的骨质疏松症（GIO）。GIO是继发性骨质疏松症的主要原因，其发病机制复杂，涉及骨吸收增加和骨形成减少。研究表明，糖皮质激素通过其经典受体（GR）发挥抗炎作用，但其导致骨质疏松的机制尚未完全明确。文章通过研究揭示了糖皮质激素通过与Tau蛋白结合，激活下游信号通路，促进破骨细胞生成和骨吸收，从而导致骨质疏松。该研究于2025年1月，发表在《Cell Research》，IF=28.1。

为了鉴定GC的潜在且未被识别的低亲和力受体，研究者利用含有超过20,000种独立打印蛋白的人类蛋白质芯片，分别检测低剂量和高剂量生物素标记的地塞米松的结合伴侣（图1a）。结果显示，低剂量和高剂量地塞米松均能与已知的地塞米松受体GR和GPR97结合（图1b和c）。考虑到地塞米松与低亲和力受体的相互作用仅在高剂量下发生，研究者比较了低剂量和高剂量地塞米松的结合谱，重点关注仅与高剂量地塞米松选择性结合的蛋白，从而鉴定出8种蛋白（图1b和c）。接下来，通过药物亲和力响应靶标稳定性（DARTS）方法，检测高剂量地塞米松处理后Raw264.7巨噬细胞裂解物中受保护的蛋白条带（图1d）。经过蛋白酶消化后，通过考马斯亮蓝染色检测到两组受保护的蛋白条带（图1e）。其中一组条带的分子量约为90 kDa，接近GR的分子量；而另一组受保护的条带分子量约为50 kDa。结合蛋白质芯片和活细胞中的靶标鉴定结果，研究者确定Tau（由选择性剪接产生的约50 kDa的蛋白亚型）是唯一可能与高剂量地塞米松结合的候选蛋白（图1f）。研究者进一步通过DARTS实验结合免疫印迹检测Tau和GR与地塞米松的相互作用。结果显示，需要10 µM的高剂量地塞米松才能明显保护Tau免受蛋白酶介导的降解，而GR的降解保护在10 nM地塞米松下即可观察到（图1g和h）。地塞米松与Tau和GR的解离常数（KD）分别为2.523 µM和0.055 µM。通过固相结合实验和单步动力学表面等离子共振（SPR）实验，进一步测得地塞米松与Tau相互作用的KD值分别为206 µM和380 µM（图1i和j）。值得注意的是，SPR实验表明，内源性糖皮质激素（如皮质酮和氢化可的松）以及合成糖皮质激素（包括泼尼松和甲泼尼龙）与Tau的结合亲和力与地塞米松相当（图1j-n）。白藜芦醇作为阴性对照未显示出与Tau的结合，化学物质亚甲蓝（MB）作为阳性对照显示出与Tau结合（图1o和p）。此外，构建Tau的不同缺失突变体与FLAG标签融合的质粒，证明Tau的富含脯氨酸区域是其与高剂量地塞米松结合所必需的。随后的分子对接模拟结合DARTS实验显示Thr212是Tau与高剂量地塞米松相互作用最关键的氨基酸。综上所述，这些结果表明Tau以一种之前未被识别的低亲和力受体的身份与高剂量糖皮质激素结合。

Tau蛋白在小鼠的许多组织中均广泛表达，在大脑、心脏、肺、肾脏、骨骼和骨髓中表达水平较高，而在肝脏和脾脏中表达水平较低（图1q）。此外，双重免疫荧光染色显示，Tau在酒石酸抗酸磷酸酶（TRAP）阳性的破骨细胞、骨钙素阳性的成骨细胞和硬化素阳性的骨细胞中均有表达（图1r）。qRT-PCR也证实，Tau在从野生型（WT）小鼠中获得的破骨细胞、成骨细胞和骨细胞中均有表达。

长期使用糖皮质激素药物会导致骨质疏松症，这是糖皮质激素治疗中最常见的副作用之一。因此，研究者首先探讨了地塞米松/Tau相互作用是否参与了地塞米松介导的骨质疏松症，使用胶原诱导性关节炎（CIA）模型进行研究（图2a）。研究构建全身GR敲除（GR^−/−）小鼠（图2b-e）。研究中使用了组成性Tau^−/−小鼠，并通过qRT-PCR确认了Tau^−/−和GR^−/−小鼠骨细胞类型（包括破骨细胞、成骨细胞和骨细胞）中Tau和GR的缺失。GR缺失使小鼠对CIA高度易感，并损害了地塞米松的抗炎作用（图2b-e），这与之前的报道一致。相比之下，Tau缺失导致CIA小鼠炎症减轻，并未损害地塞米松介导的抗炎作用（图2b-e）。值得注意的是，地塞米松在WT和GR^−/−CIA小鼠中均诱导了显著的骨质流失，但在Tau^−/− CIA小鼠中未观察到（图2f）。微计算机断层扫描（µCT）分析和TRAP染色显示，地塞米松通过促进破骨细胞活性，导致WT和GR^−/− CIA小鼠的股骨和胫骨松质骨显著流失。然而，在Tau^−/− CIA小鼠中，地塞米松诱导的骨质流失被完全消除（图2g-j）。相比之下，成骨细胞表面值在WT和Tau^−/− CIA小鼠中均显著降低，但在地塞米松处理的GR^−/− CIA小鼠中未观察到（图2k和l）。总体而言，µCT分析显示，高剂量地塞米松仅在Tau^−/−小鼠中适度但不显著地诱导股骨和胫骨松质骨流失（图2g和h）。此外，GR^−/− CIA小鼠中加剧的炎症比WT和Tau^−/− CIA小鼠诱导了更多的骨质流失（图2g和h）。综上所述，这些数据表明，用CIA小鼠模型治疗地塞米松类似于炎症性关节炎中的糖皮质激素诱导的骨质疏松症（GIO）。此外，地塞米松通过GR发挥其抗炎作用，而其不良影响（即骨吸收）则通过Tau发挥作用。

为了区分Tau和GR在无炎症情况下对地塞米松诱导的骨质流失的贡献，研究者建立了GIO模型，对雄性小鼠给予10 mg/kg体重的地塞米松，持续5周。地塞米松显著降低了WT小鼠的骨量，表现为股骨和胫骨松质骨体积分数、松质骨厚度和松质骨数量的显著降低。这种降低在地塞米松处理的GR^−/−小鼠中不明显，而在Tau^−/−小鼠中则几乎完全消除（图3a和b）。与地塞米松处理的CIA小鼠的观察结果一致，地塞米松显著增加了WT和GR^−/−小鼠股骨松质骨中的破骨细胞数量，但未增加Tau^−/−小鼠中的破骨细胞数量（图3c和d）。与这些发现一致的是，Tau缺失消除了地塞米松在WT和GR^−/−小鼠股骨中诱导的TRAP表达增加（图3e）。相比之下，地塞米松显著降低了WT和Tau^−/−小鼠的成骨细胞表面和骨形成率，但在GR^−/−小鼠中未观察到这种降低，表明GR是地塞米松介导的骨形成抑制所必需的。此外，地塞米松显著增加了WT和GR^−/−小鼠血清中骨吸收标志物CTX-1的水平（图3i）。相比之下，在Tau^−/−小鼠中，地塞米松处理后血清CTX-1水平未增加（图3i）。同时，地塞米松降低了WT和Tau^−/−小鼠血清中骨形成标志物PINP的水平，但在GR^−/−小鼠中未观察到这种降低（图3i）。由于GIO主要影响由松质骨组成的骨骼区域，如椎骨和股骨，研究者还评估了Tau缺失对椎骨骨质的影响。与研究者在股骨和胫骨中的观察结果相似，Tau缺失在Tau^−/−小鼠中也显著消除了地塞米松诱导的椎骨骨质流失，而地塞米松在WT椎骨中导致了显著的松质骨体积分数和松质骨数量减少（图3j和k）。在GR^−/−小鼠中，地塞米松倾向于减少松质骨体积分数和松质骨数量，但这种减少未达到统计学意义（图3j和k）。简而言之，GIO主要源于Tau介导的破骨细胞活性增强和随后的骨吸收对高剂量地塞米松的响应。此外，GR依赖的骨形成抑制也对GIO的发展做出了贡献。

在生理浓度下，内源性糖皮质激素对间充质细胞分化和功能至关重要，相关信号主要通过GR介导。然而，在高药理浓度下，长期使用糖皮质激素会导致GIO，这是糖皮质激素最常见的一种副作用。在人类中，GIO的特征是骨吸收迅速增加，随后骨形成受损。因此，研究者接下来探讨了Tau是否也参与了高剂量地塞米松介导的体外破骨细胞和成骨细胞生成的紊乱。高剂量地塞米松显著增强了WT和GR^−/−小鼠骨髓单核细胞的RANKL和M-CSF诱导的破骨细胞生成，但对Tau^−/−小鼠的细胞无此影响（图4a-g）。qRT-PCR分析进一步显示，高剂量地塞米松显著增加了WT和GR^−/−小鼠骨髓细胞中破骨细胞分化和骨吸收标志物NFATc1、CTSK和CTR的表达，但对Tau^−/−小鼠的细胞无此影响（图4h-j），表明高剂量地塞米松增强的破骨细胞生成依赖于Tau。一致地，通过CRISPR-Cas9技术敲除Tau，而非GR，消除了地塞米松增强的RAW264.7巨噬细胞的RANKL诱导的破骨细胞生成（图4k-m）。将Thr212突变为Asn的Tau点突变体重新引入Tau敲除的RAW264.7细胞中显示，该突变未能恢复高剂量地塞米松介导的破骨细胞生成。这一发现强调了富含脯氨酸区域在地塞米松增强的破骨细胞生成中的重要性（图4n）。此外，敲除Tau或GR在人类THP-1单核细胞中的结果与小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）和RAW264.7的结果非常相似（图4o-q）。总之，这些数据表明Tau是高剂量地塞米松介导的破骨细胞生成所必需的。

磷酸化是Tau最常见的翻译后修饰之一，可能由多种激酶在许多丝氨酸和苏氨酸残基上发生，这些修饰在生理和病理条件下均存在。为了评估高剂量地塞米松是否能够诱导Tau的磷酸化，研究者通过免疫印迹检测了经低剂量或高剂量地塞米松处理的RAW264.7细胞总蛋白中的Tau磷酸化位点Ser202/Thr205、Ser396和Ser422，这些位点在其他疾病中被广泛研究。结果显示，高剂量地塞米松优先磷酸化Tau的Ser422位点（图5a）。通过将带有这些磷酸化位点的Tau点突变体重新引入Tau敲除的RAW264.7细胞中，研究者发现Ser422位点的点突变未能恢复高剂量地塞米松介导的破骨细胞生成，进一步证实了Tau Ser422是这一过程中关键的磷酸化位点（图5b-d）。Tau是一种微管结合蛋白，通过直接与微管结合调节细胞骨架的动态变化。利用共聚焦显微镜观察总Tau、磷酸化Tau Ser422（p-Tau Ser422）和微管的荧光信号强度，研究者发现高剂量地塞米松激活了Tau在Ser422位点的磷酸化，而这种磷酸化的Tau并未与微管共定位，尽管在未处理条件下，总Tau与微管共定位良好（图5e和f）。此外，与GR主要位于细胞质中并在与GCs结合后转位至核中以调节基因转录不同，Tau和p-Tau在高剂量地塞米松刺激下主要保留在细胞质中。这些发现表明，p-Tau Ser422在介导高剂量地塞米松诱导的破骨细胞生成中并不与微管结合，也未转位至核中。为了鉴定负责Tau在Ser422位点磷酸化的激酶，研究者进行了生化共沉淀结合质谱分析，使用经高剂量生物素标记的地塞米松处理的控制和Tau敲除RAW264.7细胞（图5g和h），鉴定出5种可能被高剂量地塞米松招募至Tau的激酶。接下来，研究者通过siRNA特异性敲低TTBK1，并使用其他4种激酶的特异性药理抑制剂来确定这些激酶在高剂量地塞米松增强的破骨细胞生成中的潜在作用。这些实验结果表明，磷酸化激酶TTBK1是介导高剂量地塞米松增强破骨细胞生成中Tau Ser422磷酸化的唯一关键激酶（图5i-m）。共聚焦显微镜成像显示，高剂量地塞米松诱导TTBK1与Tau的共定位（图5n）。此外，共免疫沉淀实验揭示了地塞米松依赖的TTBK1与Tau全长的相互作用。进一步的结构域映射实验显示，Tau的C末端区域（氨基酸残基396-441）负责其与TTBK1的结合（图5o和p）。综上所述，这些结果表明，高剂量地塞米松触发TTBK1激酶被招募至Tau，导致Tau在Ser422位点的磷酸化，从而增强破骨细胞生成。

为了鉴定p-Tau Ser422下游的转录因子，可能介导高剂量地塞米松诱导的破骨细胞生成，研究者进行了另一项生化共沉淀结合质谱分析，使用经高剂量地塞米松处理的Tau敲除RAW264.7细胞转染或未转染FLAG标记的Tau（图6a）。在高剂量地塞米松处理的细胞中，鉴定出5种与Tau免疫沉淀复合物结合的转录因。基于它们的已知功能，研究者主要关注其中两种，NF-κB p105和CTCF（图6b）。NF-κB p50是通过蛋白酶体介导的加工从其前体p105中切割而来。因此，研究者通过给予p50活性抑制剂或特异性siRNA敲低CTCF，发现当p50活性被抑制时，高剂量地塞米松介导的破骨细胞生成被阻断，而CTCF的敲低则无此影响（图6c和d）。qRT-PCR分析显示，抑制p50活性消除了高剂量地塞米松增强的破骨细胞生成标志物NFATc1、CTSK和CTR的表达，并降低了RANKL诱导的破骨细胞生成（图6f-h）。此外，共免疫沉淀实验显示了地塞米松依赖的Tau与p105/p50的相互作用。进一步的结构域映射实验表明，Tau的C末端区域（氨基酸残基396-441）负责其与p105/p50的结合（图6i和j）。值得注意的是，高剂量地塞米松还刺激了p105加工为p50，而这种地塞米松依赖的p105加工为p50的过程在Tau缺失或TTBK1敲低的细胞中被阻断（图6k-n）。与先前报道一致的是，NF-κB p50倾向于与p65形成异二聚体，转位至核中并诱导破骨细胞生成，以响应RANKL（图6o和p）。此外，通过染色质免疫沉淀（ChIP）-qPCR分析p50在NFATc1启动子上的结合情况。结果表明，在高剂量地塞米松处理的WT和GR^−/−细胞中，p50与NFATc1启动子的结合增加，但在Tau^−/−细胞中未观察到这种增加（图6q-s）。然而，重新表达全长Tau而非Ser422位点的磷酸化突变体Tau S422P的Tau^−/−细胞恢复了高剂量地塞米松介导的p50与NFATc1启动子的增强结合（图6s）。综上所述，高剂量地塞米松通过磷酸化Tau激活转录因子p50，独立于GR，进而导致增强的破骨细胞生成。

由于Tau在Ser422位点的磷酸化是介导地塞米松依赖的破骨细胞生成的关键分子事件，研究者探索了抑制Tau Ser422磷酸化作为治疗GIO的潜在靶点。为此，研究者筛选了一个包含958种药物的FDA批准药物库，使用基于ELISA的高通量方法，鉴定出两种潜在药物，雷洛昔芬和TRx0237，它们可抑制地塞米松诱导的Tau在Ser422位点的磷酸化。亚甲蓝（MB）及其衍生物是已知的Tau聚集抑制剂，在阿尔茨海默病治疗中显示出有希望的临床前结果，并已进入临床试验，尽管尚未获得临床批准。TRx0237是MB的一种稳定化和还原形式，但在阿尔茨海默病患者的III期临床试验中未能显示出临床疗效（NCT01689246和NCT01689233）。在这里，研究者发现MB、TRx0237和雷洛昔芬显著抑制了地塞米松依赖的Tau在Ser422位点的激活。通过TRAP染色进行的二次筛选显示，只有MB和TRx0237以Tau依赖的方式阻断了地塞米松依赖的破骨细胞生成。此外，坑实验也证实MB和TRx0237消除了地塞米松介导的骨吸收。雷洛昔芬是一种选择性雌激素受体调节剂，是FDA批准的用于治疗绝经后骨质疏松症的药物。值得注意的是，尽管雷洛昔芬消除了地塞米松诱导的Tau在Ser422位点的磷酸化，但它未能抑制地塞米松诱导的破骨细胞生成，这表明除了Ser422位点的磷酸化外，其他翻译后修饰可能也参与了地塞米松增强的破骨细胞生成。进一步，研究者通过ChIP-qPCR实验评估了TRx0237对核NF-κB活性的影响，TRx0237显著抑制了p50及其共调节因子p65与NFATc1启动子的结合。这种抑制在p50敲低的RAW264.7细胞中未观察到（图6t和u），证实了增加的核p50活性是高剂量地塞米松增强破骨细胞活性的罪魁祸首。总之，TRx0237作为一种Tau抑制剂，有望拮抗地塞米松诱导的Tau依赖性破骨细胞生成。

接下来，研究者探讨了TRx0237在体内是否对GIO具有治疗作用。地塞米松未在Tau^−/−小鼠中引起明显的骨质流失，TRx0237对Tau^−/−小鼠的骨质没有影响，无论是松质骨BV/TV、厚度还是数量。组织学分析显示，TRx0237消除了地塞米松诱导的WT和GR^−/−小鼠长骨和椎骨中的破骨细胞活性，但未影响成骨细胞表面值。TRx0237阻断了地塞米松处理的WT和GR^−/−小鼠血清中CTX-1水平的升高，但未影响骨形成标志物PINP的水平。与研究者在体外观察到的TRx0237通过抑制p-Tau Ser422消除地塞米松介导的破骨细胞活性一致，TRx0237显著降低了GIO小鼠骨组织中Tau在Ser422位点的磷酸化。总之，研究者从FDA批准的药物库中成功分离出TRx0237，它在体内保护了GIO。值得注意的是，在GR^−/−小鼠中，尽管地塞米松未显著降低长骨和椎骨的松质骨体积和松质骨数量，但Tau抑制剂TRx0237仍显著减轻了骨质流失。这一发现进一步强调了Tau在介导GIO中骨吸收的重要作用。接下来，研究者询问了TRx0237在WT GIO小鼠模型中的潜在剂量依赖性效应，即使是最低剂量的TRx0237也有效降低了地塞米松诱导的血清中骨吸收标志物CTX1水平，尽管它对骨形成标志物PINP没有影响。此外，最低剂量的TRx0237阻断了地塞米松诱导的破骨细胞活性。与研究者在体外观察到的TRx0237通过抑制Tau在Ser422位点的磷酸化消除地塞米松介导的破骨细胞活性一致，所有剂量的TRx0237显著降低了GIO小鼠骨组织中Tau在Ser422位点的磷酸化，与未处理的GIO小鼠相比。值得注意的是，最高剂量的TRx0237将地塞米松激活的Tau在Ser422位点的磷酸化降低到了未处理水平。总之，研究者在当前研究中使用的剂量均有效消除了地塞米松引起的骨质流失，进一步的研究需要确定TRx0237的最佳最低剂量。

研究者使用地塞米松处理的CIA小鼠来确定地塞米松与TRx0237联合治疗是否能够在保留抗炎作用的同时克服地塞米松诱导的骨质流失。联合治疗在CIA小鼠中诱导的抗炎效果与地塞米松单药治疗相当（图7a-c）。值得注意的是，与研究者在体外观察到的遗传性Tau缺失预防GIO一致，TRx0237在地塞米松处理的CIA小鼠中通过抑制破骨细胞活性有效地保护了骨质流失，而对成骨细胞无影响（图7d-m）。免疫组化染色显示，地塞米松依赖的Tau在Ser422位点的磷酸化在CIA小鼠中也被TRx0237消除（图7n和o），进一步支持了p-Tau Ser422作为骨质疏松症治疗靶点的鉴定。总之，这些数据表明，地塞米松与TRx0237的联合治疗在治疗炎症性关节炎时保留了抗炎作用，同时避免了地塞米松的不良骨吸收效应。研究者还检查了健康对照组和骨质疏松症患者骨组织中p-Tau Ser422与骨质流失之间的关联。与健康个体的骨组织相比，骨质疏松症患者的骨组织中观察到显著更高的p-Tau Ser422水平（图7p和q），强调了靶向/抑制p-Tau Ser422的治疗药物（如TRx0237）可能在临床上预防骨质流失的广泛应用，包括GIO。

文章发现Tau蛋白是糖皮质激素的低亲和力受体，其在糖皮质激素诱导的骨质疏松症中发挥关键作用。通过抑制Tau蛋白的活性或阻断其与糖皮质激素的结合，可以有效预防糖皮质激素引起的骨质疏松症，同时不影响其抗炎作用。

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Fu W, Chen M, Wang K, Chen Y, Cui Y, Xie Y, Lei ZN, Hu W, Sun G, Huang G, He C, Fretz J, Hettinghouse A, Liu R, Cai X, Zhang M, Chen Y, Jiang N, He M, Wiznia DH, Xu H, Chen ZS, Chen L, Tang K, Zhou H, Liu CJ. Tau is a receptor with low affinity for glucocorticoids and is required for glucocorticoid-induced bone loss. Cell Res. 2025 Jan;35(1):23-44. doi: 10.1038/s41422-024-01016-0. Epub 2025 Jan 2. PMID: 39743632; PMCID: PMC11701132.