铁死亡中性粒细胞诱导乳腺癌免疫抑制和化疗耐药

在肿瘤细胞中诱导铁死亡正在成为治疗传统治疗方式难治性恶性肿瘤的一种策略。然而，需要更好地了解免疫细胞在肿瘤微环境中铁死亡的后果，以实现这种方法的潜力。在这项研究中，我们发现化疗耐药乳腺癌中的中性粒细胞对铁死亡高度敏感。化疗耐药相关中性粒细胞中酰基转移酶 MOAT1 的减少诱导了磷脂重编程，将偏好从单不饱和脂肪酸转变为多不饱和脂肪酸，这增加了它们对铁死亡的易感性。铁死亡中性粒细胞分泌 PGE2 、 IDO 和氧化脂质，抑制抗肿瘤 CD8+ T 细胞的增殖和细胞毒性。此外，中性粒细胞铁死亡与 IL1β + CXCL3 + CD4 + （Fer-CD4） T 淋巴细胞的一个独特亚群密切相关，这些细胞在化疗耐药肿瘤中富集。Fer-CD4 T 细胞通过 IL1β/IL1R1/NF-κB 信号传导调节 MOAT1 表达，从而协调中性粒细胞铁死亡。此外，Fer-CD4 T 细胞分泌 CXCL3 、 IL8 和 S100A9 以补充肿瘤微环境中的中性粒细胞库。铁死亡中性粒细胞反过来促进了 Fer-CD4 T 细胞分化。在自发性肿瘤发生小鼠模型中，靶向 IL1β+ CD4+ T 细胞或 IL1R1+ 中性粒细胞打破串扰，抑制中性粒细胞铁死亡，增强抗肿瘤免疫，克服化疗耐药。总体而言，这些发现揭示了中性粒细胞铁死亡在塑造免疫景观中的作用，并为恢复乳腺癌的免疫监视和化疗敏感性提出了有吸引力的靶点。本文于2025年1月发表于《Cancer Research》，IF：13.3

技术路线：

研究结果：

1. 化疗耐药乳腺癌中的中性粒细胞容易发生铁死亡

为了确定具有不同化疗敏感性的乳腺癌中 TIN 的异质性，使用磁激活细胞分选从化疗敏感和化疗耐药患者中纯化中性粒细胞进行转录组测序分析。值得注意的是，化疗耐药性肿瘤中性粒细胞表现出独特的转录特征，与铁结合、DNA 损伤反应、泛素化和热休克蛋白相关的特征上调（图 1A）。此外，与氧化应激和氧化剂解毒相关的基因的表达也显着升高。这些观察结果表明，化疗耐药肿瘤中性粒细胞可能经历了氧化应激并伴有铁调节失调，这表明潜在的铁死亡相关活性。

在化疗耐药 TIN 中观察到的细胞死亡高于化疗敏感 TIN。为了研究铁死亡在化疗耐药中性粒细胞中的作用，分离了瘤内中性粒细胞并用各种细胞死亡抑制剂处理。值得注意的是，与细胞凋亡抑制剂（z-VAD-FMK）或坏死抑制剂（necrostatin-1）相比，铁死亡抑制剂（ferrostatin-1 或去铁胺）的给药显着增加了化疗耐药中性粒细胞的活力（图 1B）。相比之下，铁死亡抑制剂对化疗敏感的中性粒细胞影响最小。此外，化疗耐药中性粒细胞在暴露于对化疗敏感的中性粒细胞安全的剂量 RSL3（一种铁死亡诱导剂）后发生显着的细胞死亡（图 1C）。此外，电子显微镜显示，线粒体收缩和线粒体嵴减少，这是铁死亡的特征性形态学标志，在化疗耐药中性粒细胞中，但在敏感中性粒细胞中没有（图 1D）。使用 BODIPY C11 染色，我们观察到化疗耐药中性粒细胞的脂质过氧化水平显着升高，这表明铁死亡（图 1E 和 F）。化疗耐药的中性粒细胞始终表现出转铁蛋白受体（CD71）的显著较高表达，这是铁死亡的另一个指标。这些数据表明，化疗耐药肿瘤中性粒细胞极易发生铁死亡。

为了临床评估中性粒细胞化疗敏感性与铁死亡之间的相关性，对 468 例接受新辅助化疗的乳腺癌患者的肿瘤标本进行了免疫荧光共聚焦成像。我们观察到化疗耐药中性粒细胞的铁死亡特征（4-HNE）明显高于化疗敏感的中性粒细胞（图 1G 和 H）。此外，与乳腺癌亚型无关，原发肿瘤中 4-HNE+ 中性粒细胞的较高浸润与队列中较短的无病生存期和总生存期相关（图 1I）。总的来说，我们揭示了化疗耐药肿瘤中的 TIN 表现出对铁死亡的高度敏感性，而铁死亡 TIN 与乳腺癌的化疗耐药和不良预后相关。

Figure 1 化疗耐药乳腺癌中的中性粒细胞容易发生铁死亡

2. MBOAT1 改变化疗耐药中性粒细胞的磷脂谱和铁死亡脆弱性

鉴于化疗耐药中性粒细胞中明显的脂质过氧化，我们对 5 名化疗敏感和 5 名化疗耐药乳腺癌患者的 TIN 进行了脂质组学分析。化疗耐药性中性粒细胞显示出独特的磷脂谱，显著下调广谱磷脂-单不饱和脂肪酸（PL-MUFA），包括磷脂酰乙醇胺（PE）-MUFA、磷脂酰胆碱（PC）-MUFA 和磷脂酰丝氨酸 MUFA。其中，PE-MUFAs，特别是那些含有油酰基（18：1）尾部的 PE-MUFAs，表现出最明显的减少（图 2A）。相反，几种磷脂-多不饱和脂肪酸（PL-PUFA）的水平在化疗耐药中粒细胞中显着升高，其中 PE-PUFA 占主导地位（图 2B）。此外，在化疗耐药中性粒细胞中，具有花生六烯酰（PE-AA， 20：4）尾部的 PE 显著积累，极易发生过氧化，是铁死亡易感性的主要决定因素。

为了研究磷脂重编程和铁死亡在化疗耐药中性粒细胞的调节作用，使用转录组分析和 qRT-PCR 分析了与调节脂质代谢和铁死亡有关的基因。与化疗敏感的中性粒细胞相比，化疗耐药中性粒细胞在与铁死亡防御系统（GPX4、SLC7A11、FSP1、DHODH、GCH1 和 NOS2）或脂质过氧化和铁代谢（ALOX15、POR、NCOA4、GOT1、NFS1 和 CISD2;图 2C）。同样，参与合成含不饱和脂肪酸的磷脂的基因（SCD、ACSL3、ACACA、ACACB、ACSL4、LPCAT3 和 MBOAT2）没有表现出任何显着变化（图 2C）。有趣的是，化疗耐药中性粒细胞中 MBOAT1 水平急剧降低，MBOAT1 是一种参与 PL-MUFA 产生的磷脂修饰酶（图 2D），免疫印迹证实了这一点（图 2E）。MBOAT1 是一种溶血磷脂酰基转移酶，可催化 MUFA 向溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰丝氨酸或溶血磷脂酰胆碱转移。耐化疗的中性粒细胞中 MBOAT1 水平的变化与磷脂脂肪酸组成一致，PL-PUFA 明显优于 PL-MUFA。为了阐明 MBOAT1 在铁死亡细胞死亡中的作用，我们在 CD34 + 髓系祖细胞分化为中性粒细胞之前过表达或沉默 MBOAT1。然后，如前所述，将祖细胞来源的中性粒细胞与通过离体外植体测定获得的化疗敏感或化疗耐药肿瘤组织的 CM 一起孵育。用化疗耐药性乳腺肿瘤而不是化疗敏感的乳腺肿瘤进行调节，触发了野生型祖细胞衍生的中性粒细胞的细胞死亡和脂质过氧化，验证了实验模型的可靠性。通过 qRT-PCR 和免疫印迹证实祖细胞来源的中性粒细胞中 MBOAT1 过表达，并通过流式细胞术验证祖细胞来源的中性粒细胞在调节前的活力。值得注意的是，与用对照载体转导的中性粒细胞相比，MBOAT1 过表达减轻了脂质过氧化，并逆转了受化疗耐药肿瘤条件的祖细胞衍生的中性粒细胞的铁死亡脆弱性（图 2F 和 G）。此外，MBOAT1 过表达的中性粒细胞的磷脂谱发生改变，与对照编辑的中性粒细胞相比，油酰基尾部的 PE 增加，PE-AA 减少（图 2H）。相比之下，在 MBOAT1 沉默后，受化疗敏感肿瘤条件的祖细胞衍生的中性粒细胞变得易患铁死亡（图 2I）。这些结果表明，MBOAT1 缺陷破坏了磷脂产生的平衡，有利于产生含 PUFA 的磷脂而不是 PL-MUFAs，使化疗耐药性中性粒细胞极易患铁死亡。

Figure 2 MBOAT1 重塑了化疗耐药中性粒细胞的磷脂谱和铁死亡脆弱性

3. 铁亡中性粒细胞是有效的免疫抑制剂

为了评估中性粒细胞铁死亡对肿瘤微环境的影响，我们对乳腺癌患者的连续肿瘤切片进行了多重免疫荧光染色。值得注意的是，在 4-HNE+ 中性粒细胞比例较高的肿瘤中，CD8 T 细胞的密度明显低于中性粒细胞比例较低的肿瘤（补充图 S3A）。然而，基质细胞和其他免疫细胞（包括巨噬细胞、成纤维细胞、DC、内皮细胞、NK 细胞和 B 细胞）的瘤内数量在 4-HNE+ 中性粒细胞比例低或高比例的乳腺肿瘤之间没有显著差异。此外，我们收集了肿瘤样本以分离中性粒细胞并制备肿瘤裂解物以及配对的血液样本，从中产生 DC，并从化疗耐药或化疗敏感患者中纯化 CD8 T 细胞（图 3A）。流式细胞术证实化疗耐药中性粒细胞中 4-HNE 的表达升高。在与自体 CD8 T 细胞共培养之前，用肿瘤裂解物脉冲 DC 以产生肿瘤特异性 CTL。通过 IFN-γ ELISPOT 测定和肿瘤抗原肽/MHC-I 五聚体染色验证生成的 CTL 对肿瘤抗原的识别。然后将肿瘤来源的中性粒细胞与 CTLs 共培养，并评估其增殖和细胞死亡。有趣的是，化疗耐药性中性粒细胞对 CD8 T 细胞的死亡没有显着影响，但显着减弱了 CD8 T 细胞的增殖（图 3B）。在化疗敏感的 TIN 中未观察到这种效果（图 3B）。此外，化疗耐药性肿瘤来源的中性粒细胞在很大程度上抑制了 CTL 产生穿孔素和颗粒酶 B（图 3C）。用铁死亡抑制剂而不是细胞凋亡或坏死抑制剂预处理中性粒细胞，有效地逆转了化疗耐药中性粒细胞对抗肿瘤 CTLs 增殖和细胞因子释放的抑制作用。与此一致，对 468 名乳腺癌患者队列的肿瘤样本序列切片进行免疫荧光分析，显示铁死亡中性粒细胞与颗粒酶 B+ CD8 T 淋巴细胞之间存在显着的负相关（图 3E 和 F）。此外，在 MMTV-PyMT 自发致瘤小鼠的肿瘤中也观察到 4-HNE+ 中性粒细胞。同样，在铁死亡中性粒细胞比例高的区域，与铁死亡中性粒细胞较少的区域相比，颗粒酶 B+ CD8 T 淋巴细胞的密度显着降低。

为了阐明中性粒细胞如何损害 CTL 功能，使用了非接触式共培养系统。消除直接接触并未消除化疗耐药中性粒细胞对 CTL 的抑制作用。分离化疗耐药中性粒细胞的培养基成分，并在淋巴细胞上进行测试，以确定其免疫作用。通过纳米颗粒追踪分析验证的 CM 的细胞外囊泡耗尽（EV-d）部分对 CTL 增殖和颗粒酶 B 的产生表现出显着的抑制活性（图 3G）。为了确定 EV-d 部分内影响 T 细胞功能的分子基础，从 EV-d 部分去除了蛋白质、核酸和脂质。蛋白质或脂质而不是核酸的消除有效地降低了化疗耐药中性粒细胞 EV-d 组分的淋巴细胞调节能力（图 3H）。这表明化疗耐药中性粒细胞的免疫抑制作用归因于可溶性蛋白质介质和脂质的释放。我们使用 ELISA 测量了敏感和耐药中性粒细胞在 CM 中表现出 T 细胞调节活性的各种细胞因子和可溶性因子的水平。与化疗敏感的中性粒细胞相比，化疗耐药中性粒细胞的 PGE2 和 IDO 在 CM 中显著升高（图 3I）。免疫荧光染色和免疫印迹证实了这一点，结果显示化疗耐药中性粒细胞中存在丰富的 IDO。IDO 是 Trp 转化为 Kyn 的限速酶。培养 24 小时后，从化疗敏感和化疗耐药的中性粒细胞中分离出 CM。值得注意的是，与化疗敏感中性粒细胞的 CM 不同，来自化疗耐药中性粒细胞的 CM 表现出显著的 IDO 酶活性，其将 Trp 转化为 Kyn 的能力证明了这一点。此外，PGE2 是免疫应答的负调节分子。当我们抑制 CTLs 中的 PGE2 受体 EP2 和 EP4 时，化疗耐药中性粒细胞对 CTL 增殖和细胞因子产生的抑制作用显着降低。此外，用 IDO （1-MT）、COX1 和 COX2 抑制剂（COXi、酮咯酸和罗非昔布）对化疗耐药中性粒细胞进行预处理，大大阻碍了对 CTL 中 IFNγ、穿孔素和颗粒酶 B 扩增和产生的抑制作用（图 3J-L）。此外，将 CTLs 与化疗耐药中性粒细胞共培养会损害 CTLs 对肿瘤细胞的溶细胞活性，而用 1-MT 和 COXi 处理可有效逆转这种活性（图 3M）。然而，由于化疗耐药性中性粒细胞表现出明显的脂质过氧化迹象，我们检查了氧化脂质对 CD8 T 细胞活性的潜在影响。将氧化的 PE-AAs 施用到肿瘤特异性 CD8 T 细胞中显着损害了它们的增殖和细胞因子合成，表明氧化脂质参与化疗耐药性中性粒细胞介导的免疫抑制。总的来说，这些发现表明，亚铁性中性粒细胞通过 PGE2、IDO 和过氧化物脂质促进强大的免疫抑制。

Figure 3 铁死亡中性粒细胞是强烈的免疫抑制因子

4. 肿瘤中性粒细胞铁死亡与化疗耐药肿瘤中富集的独特 CD4 T 细胞亚群有关

为了鉴定 TME 中负责调节 MBOAT1 和中性粒细胞铁死亡的细胞，我们从化疗耐药肿瘤中纯化了各种细胞类型，并将它们与外周血衍生的中性粒细胞共培养。值得注意的是，只有与化疗耐药 TME 的 CD4 T 淋巴细胞相互作用，而不是与上皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、DC、内皮细胞、B 细胞、CD8 T 细胞或 NK 细胞的相互作用，才会诱导中性粒细胞对铁死亡的相当易感性，并下调 MBOAT1。然而，在化疗敏感的中性粒细胞中未观察到这些影响。

为了鉴定参与中性粒细胞铁死亡的 CD4 T 淋巴细胞亚群，我们对化疗敏感和化疗耐药乳腺肿瘤的 CD4 T 淋巴细胞进行了单细胞转录组学。在 CD4 T 细胞中鉴定出 6 个亚群：C0_IF144L、C1_TCF7、C2_IL1B、C3_FOXP3、C4_IFNG 和 C5_PISD（图 4A）。CD4 T 细胞的 C2_IL1B 亚组以 IL1B 和 CXCL3 表达升高为特征，在化疗敏感患者中很少见，但在化疗耐药患者中占 CD4 T 淋巴细胞的很大一部分（4.5% vs. 22.7%；图 4B-D）。一致地，来自另外 18 名患者的 CD4 T 细胞的大量 RNA-seq显示，与来自化疗敏感肿瘤的 CD4 T 细胞相比，浸润化疗耐药恶性肿瘤表现出 IL1B 和 CXCL3 的表达明显更高（图 4E），通过蛋白质印迹验证。此外，流式细胞术分析显示，与化疗敏感病例相比，IL1β和 CXCL3 描绘了在化疗耐药乳腺癌中显著富集的 CD4 T 细胞亚群（图 4F）。

使用细胞因子捕获磁珠，我们从化疗耐药乳腺肿瘤中纯化了 IL1β+ CXCL3+ CD4 T 细胞，如流式细胞术证实的那样，并将它们与外周中性粒细胞共培养。随后，我们在暴露于 IL1β + CXCL3 + CD4 T 细胞的中性粒细胞中观察到显著的细胞死亡，但在暴露于成对的 IL1β + CXCL3 + 耗尽（IL1β+ CXCL3+-d） CD4 T 细胞的中性粒细胞中没有观察到显著的细胞死亡，这被铁死亡抑制剂逆转（图 4G）。一致地，与 IL1β + CXCL3 + CD4 T 细胞共培养后，中性粒细胞表现出脂质过氧化和 CD71 表达的显着增加（图 4H）并强烈抑制 CTL 增殖和溶细胞活性（图 4I）。此外，暴露于 IL1β + CXCL3 + CD4 T 细胞后，在中性粒细胞中检测到 MBOAT1 下调。临床上，与敏感肿瘤相比，IL1β + CXCL3 + CD4 T 细胞在化疗耐药肿瘤中显著富集（图 4J）。此外，在乳腺癌标本中观察到 IL1β + CXCL3 + CD4 T 细胞与铁死亡中性粒细胞之间存在显着的正相关（图 4K）。这些数据表明，在化疗耐药乳腺癌微环境中富集的 IL1β + CXCL3 + CD4 T 细胞负责肿瘤中性粒细胞的脂质重塑和铁死亡。

与此一致，免疫荧光染色显示 MMTV-PyMT 自发性致瘤小鼠肿瘤中存在 IL1β + CXCL3 + CD4 T 细胞，并且 IL1β + CXCL3 + CD4 T 细胞的比例与铁死亡中性粒细胞呈正相关。我们从小鼠肿瘤中分离出 IL1β + CXCL3 + CD4 T 细胞，并将它们与来自骨髓的中性粒细胞共培养。同样，在中性粒细胞与 IL1β + CXCL3 + CD4 T 细胞共培养后，中性粒细胞表现出脂质过氧化的显著升高，并且容易发生细胞死亡，这被铁死亡抑制剂抑制。此外，暴露于 IL1β + CXCL3 + CD4 T 细胞的小鼠中性粒细胞中 MBOAT1 表达存在明显缺陷。

Figure 4 肿瘤中性粒细胞铁死亡与化疗耐药肿瘤中富集的 CD4 T 细胞的独特亚群有关

5. 铁死亡诱导的 CD4 T 细胞通过 IL1β/IL1R1/NF-κB 信号转导使肿瘤中性粒细胞易发生铁死亡

为了研究 IL1β + CXCL3 + CD4 T 细胞（以下简称铁死亡诱导 CD4 T 细胞（Fer-CD4））沉淀中性粒细胞铁死亡的机制，我们在非接触 Transwell 系统中将它们与中性粒细胞共培养。分离 Fer-CD4 T 细胞与中性粒细胞的共培养刺激了中性粒细胞中的脂质过氧化和铁死亡（补充图 S6A），与它们的 IL1β-CXCL3-对应物（非 Fer-CD4 T 细胞）相反，表明 Fer-CD4 T 细胞以接触非依赖性方式促进中性粒细胞铁死亡。鉴于乳腺癌患者肿瘤中 CD4 T 细胞和铁死亡中性粒细胞中 IL1β和 CXCL3 表达之间的相关性（图 4K），我们研究了 IL1β和 CXCL3 在化疗耐药乳腺癌中中性粒细胞铁死亡调节中的作用。值得注意的是，在非接触共培养系统中中和 IL1β而不是 CXCL3 抑制了 Fer-CD4 T 细胞诱导的脂质过氧化和中性粒细胞铁死亡（图 5A 和 B）。qRT-PCR、免疫印迹和免疫荧光显示 IL1R1 在中性粒细胞中的表达，在与 Fer-CD4 T 细胞相互作用后进一步增加（图 5C）。这与 IL1β刺激 IL1R1 表达，从而形成正反馈回路的报告一致。同样，小鼠中性粒细胞表达 Il1r1（编码小鼠 IL1R1），其在暴露于 Fer-CD4 T 细胞时上调。为了阐明 IL1R1 在中性粒细胞铁死亡中的作用，在细胞分化为中性粒细胞之前，使用 shRNA 敲低 CD34+ 中性粒细胞祖细胞中的 IL1R1。与 Fer-CD4 T 细胞共培养诱导祖细胞来源的中性粒细胞铁死亡和脂质过氧化，并发 MBOAT1 缺陷，其被 IL1R1 沉默逆转（图 5D 和 E）。

为了确定导致中性粒细胞铁死亡的信号通路，使用了免疫印迹、免疫荧光和不同信号通路的抑制剂。免疫印迹显示 NF-κB/p65 的磷酸化增加，而不是 MAPK/p38 或 PI3K/Akt（图 5F），而免疫荧光显示 p65 在与 Fer-CD4 T 细胞结合的中性粒细胞中核易位。此外，NF-κB 抑制剂（JSH23）而不是 MAPK/p38 （SB202190）或 PI3K （LY294002）抑制剂的给药恢复了 MBOAT1 表达并抑制了 Fer-CD4 T 细胞触发的中性粒细胞铁死亡（图 5G）。此外，施用 IL1β中和抗体或 IL1R1 拮抗剂（Anakinra）可防止 Fer-CD4 T 细胞诱导 NF-κB 磷酸化（图 5H）、p65 核转位（图 5I）和 MBOAT1 缺陷（图 5J）中。这些结果表明，Fer-CD4 T 细胞激活 TIN 中的 IL1R1/NF-κB 信号传导并促进细胞铁死亡。一致地，在 468 名乳腺癌患者的队列中，肿瘤内 Fer-CD4 T 细胞的丰度与较短的总生存期和无病生存期相关（图 5K），这与乳腺癌亚型无关。

Figure 5 铁死亡诱导的 CD4 T 细胞通过 IL1β/IL1R1/NF-κB 信号传导使肿瘤中性粒细胞易发生铁死亡

6. 中性粒细胞和 Fer-CD4 T 细胞之间的串扰维持了广泛的中性粒细胞铁死亡

最近的研究表明，铁死亡的传播性质会导致大规模细胞死亡。与此一致，我们在肿瘤核心中观察到中性粒细胞积累和大量铁死亡。因此，我们很感兴趣地研究肿瘤中心内是否存在维持和放大中性粒细胞铁死亡的过程。scRNA-seq 数据的基因本体分析显示，白细胞吸引信号通路，尤其是中性粒细胞趋化性相关通路，在 C2_IL1B 细胞中上调（图 6A）。同样，来自化疗耐药肿瘤的 CD4 T 细胞在大量 RNA-seq 中表现出中性粒细胞募集途径的表达升高（图 6B）。这些数据表明 Fer-CD4 T 细胞也具有中性粒细胞趋化和聚集的潜力。为了阐明 Fer-CD4 T 细胞在中性粒细胞募集中的作用，使用 Boyden Transwell 室进行趋化性测定（图 6C）。我们发现，与非 Fer-CD4 T 细胞相比，Fer-CD4 T 细胞的 CM 显着增强了中性粒细胞的迁移能力（图 6D）。同样，来自肿瘤的小鼠 Fer-CD4 T 细胞显示出吸引骨髓来源的中性粒细胞的能力。在微载玻片趋化性实验中，中性粒细胞在纤连蛋白预包被的μ载玻片上主动迁移到 Fer-CD4 T 细胞的 CM，而在存在来自非 Fer-CD4 T 细胞的 CM 的情况下，它们的移动更加不稳定（图 6E）。一致地，细胞骨架染色显示，用 Fer-CD4 T 细胞的 CM 处理的中性粒细胞表现出明显的 F-肌动蛋白重排，具有极化分布，主要位于细胞的前缘，而那些用来自非 Fer-CD4 T 细胞的 CM 处理的中性粒细胞具有分散的 F-肌动蛋白染色（图 6F）。此外，采用离体肿瘤切片迁移测定来评估中性粒细胞向 TME 的募集。在计算浸润性中性粒细胞的数量之前，将新鲜切除的乳腺癌切片与预先标记的自体 PB 衍生的中性粒细胞叠加。在这项研究中，来自高水平 Fer-CD4 T 细胞浸润患者的肿瘤切片吸引了明显更多的自体中性粒细胞（图 6G）。这些发现表明，Fer-CD4 T 细胞有效地将中性粒细胞募集到 TME 中，补充了因死亡而减少的 TME 中性粒细胞库，并在它们附近积累了中性粒细胞。

接下来，我们检查了 Fer-CD4 T 细胞中的趋化因子表达模式。scRNA 测序显示，C2_IL1B 细胞表达的 CXCL3、CXCL8（编码 IL8）和 S100A9 水平升高（图 6H）。qRT-PCR 和 ELISA 证实，Fer-CD4 T 细胞产生的 CXCL3、IL8 和 S100A9 量明显高于非 Fer-CD4 T 淋巴细胞（图 6I）。为了确定中性粒细胞趋化性的关键因素，我们使用中和抗体抑制了 Fer-CD4 T 细胞 CM 中的各种细胞因子和趋化因子。CXCL3、IL8 或 S100A9 的中和显着抑制了中性粒细胞迁移到 Transwell 系统的下腔（图 6J）和中性粒细胞骨架重塑（图 6K）。抑制 CXCL3 对这两个过程都产生了最大的影响，导致下腔中铁死亡中性粒细胞显着减少（图 6L）。这些结果表明，通过分泌一系列趋化因子，包括 CXCL3、IL8 和 S100A9，肿瘤浸润性 Fer-CD4 T 细胞吸引并聚集在肿瘤核心中的中性粒细胞，促进连续和局部的中性粒细胞铁死亡。

为了确定铁死亡中性粒细胞对 CD4 T 细胞的影响，在 CD3/CD28 Dynabeads 存在下，将初始 CD4 T 细胞与来自 Fer-CD4 T 细胞的 CM 预处理产生的铁死亡中性粒细胞共培养。有趣的是，与亚铁死亡中性粒细胞共培养显着抑制了 CD4 T 细胞产生 IFNγ和 IL4并显着减轻了 CD4 T 细胞增殖；然而，它显着刺激了 IL1β和 CXCL3 的合成（图 6M）。这表明铁死亡中性粒细胞反过来可以促进 Fer-CD4 T 细胞的分化。这些数据揭示了 Fer-CD4 T 细胞和中性粒细胞之间的相互反馈调节。Fer-CD4 T 细胞通过 IL1β启动中性粒细胞铁死亡，并通过 CXCL3、IL8 和 S100A9 补充中性粒细胞水平。反过来，铁死亡中性粒细胞促进 Fer-CD4 T 细胞的发育，产生正反馈回路。这种 CD4 T 细胞-中性粒细胞串扰使肿瘤核心中持续和广泛的中性粒细胞铁死亡成为可能，为肿瘤提供针对 CD8 T 细胞介导的抗肿瘤免疫的持续保护。

Figure 6 中性粒细胞和 Fer-CD4 T 细胞之间的串扰维持了广泛的中性粒细胞铁死亡

7. 破坏 Fer-CD4 T 细胞和中性粒细胞之间的串扰可增强抗肿瘤免疫力和化疗敏感性

为了评估在体内破坏中性粒细胞和 Fer-CD4 T 细胞之间有害相互作用的策略的治疗潜力，我们将 Cd4-Il1b^Δ转基因小鼠（其中 IL1β + CD4 T 淋巴细胞耗尽）与自发致瘤 MMTV-PyMT 小鼠杂交。当可触及的肿瘤发生时，给予化疗药物。IL1β+ CD4 T 细胞的耗竭显著提高了化疗效果，并有效延缓了乳腺肿瘤的生长（图 7A），诱导了大量肿瘤细胞死亡（图 7B）。肿瘤样本的免疫荧光分析显示，与 ADM 处理的野生型小鼠相比，化疗治疗的 Cd4-Il1b^Δ小鼠的肿瘤浸润 CTL 密度显着增加，而瘤内 CD4 T 细胞的数量未观察到明显变化。此外，IL1β+ CD4 T 细胞的缺失显著降低了 TIN 中的脂质过氧化和 CD71 表达（图 7C）。此外，在化疗处理的 Cd4-Il1b^Δ小鼠中，肿瘤浸润的 CD8 T 细胞不仅密度增加，而且细胞溶解细胞因子的合成增加，包括穿孔素和颗粒酶 B（图 7D）。免疫荧光成像进一步支持了这一点（图 7E）。同样，IL1β中和抗体的给药不影响 CD4 T 细胞的存活或增殖与化疗联合使用显着减缓了肿瘤生长。此外，观察到中性粒细胞脂质过氧化减少，CTL 细胞因子产生增加。

此外，当使用 Ly6G 抗体从 Cd4-Il1bΔ转基因小鼠中消除中性粒细胞时，中性粒细胞耗竭对肿瘤生长没有明显的加性影响，表明 Fer-CD4 T 细胞调节中性粒细胞功能。为了进一步阐明 Fer-CD4 T 细胞和中性粒细胞之间相互调控的重要性，构建了 Mrp8-Il1r1^Δ转基因小鼠，其中 IL1R1+ 中性粒细胞被删除。值得注意的是，消除 IL1R1 + 中性粒细胞显着抑制了肿瘤生长并诱导了广泛的肿瘤细胞死亡，增强了化疗的疗效（图 7F）。一致地，流式细胞术显示中性粒细胞中脂质过氧化水平较低，而 CTL 中杀瘤细胞因子的产生水平较高，包括穿孔素和颗粒酶 B（图 7G）。值得注意的是，消除 IL1R1 + 中性粒细胞导致瘤内 Fer-CD4 T 细胞密度降低。综上所述，这些数据表明，破坏 Fer-CD4 T 细胞和中性粒细胞之间的正反馈回路是抑制中性粒细胞铁死亡、逆转免疫抑制和增强化疗敏感性的有效治疗策略。

Figure 7 打破 Fer-CD4 T 细胞和中性粒细胞之间的串扰增强了抗肿瘤免疫力和化疗敏感性

结论

值得注意的是，我们的结果揭示了化疗耐药 TME 中 TIN 中铁死亡的正反馈扩增回路，与 CD4 T 细胞和中性粒细胞之间的相互作用密切相关。具体来说，Fer-CD4 T 细胞通过 IL1β/NF-κB/MBOAT1 信号传导引发中性粒细胞铁死亡，并通过 CXCL3、IL8 和 S100A9 吸引和聚集中性粒细胞，维持 TME 中大部分的铁死亡中性粒细胞。反过来，铁死亡中性粒细胞促进了 Fer-CD4 T 细胞的分化。因此，大量且持久的铁死亡中性粒细胞群体对抗肿瘤免疫产生强大的抑制作用，从而抵消化疗诱导的免疫益处。因此，破坏铁死亡的扩增回路可能是恢复抗肿瘤免疫和增强治疗反应的关键方法。

实验方法：

从肿瘤组织中分离原代细胞，流式细胞术，bulk RNA 测序，qRT-PCR 检测，细胞培养和细胞共培养，细胞死亡检测，电子显微镜，脂质过氧化的测量，免疫荧光染色，脂质组学分析，蛋白质印迹分析，肿瘤条件性中性粒细胞的产生，慢病毒介导的表达和短发夹 RNA 介导的沉默，CRISPR 介导的基因敲除，中性粒细胞分化，外周血免疫细胞分离，产生肿瘤特异性 DC 和 T 细胞，ELISPOT 检测，细胞毒性检测，酶联免疫吸附试验，IDO 酶活性的测量，单细胞 RNA-seq 和数据处理，基于细胞因子分泌的 CD4 淋巴细胞分离，Boyden 趋化性测定，Microslide 趋化性测定，离体肿瘤切片迁移测定，小鼠研究，TUNEL 测定，统计分析。

参考文献：

Zeng W, Zhang R, Huang P, Chen M, Chen H, Zeng X, Liu J, Zhang J, Huang D, Lao L. Ferroptotic Neutrophils Induce Immunosuppression and Chemoresistance in Breast Cancer. Cancer Res. 2025 Feb 1;85(3):477-496. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-24-1941. PMID: 39531510; PMCID: PMC11786957.