RNA pull-down实验
栏目:英拜特色服务 发布时间:2017-09-06
RNA pull-down实验是检测与目的RNA结合的蛋白质。使用体外转录法标记生物素RNA探针......

RNA pull-down实验是检测与目的RNA结合的蛋白质。使用体外转录法标记生物素RNA探针,然后与胞浆蛋白提取液孵育,形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合,从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后,通过western blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。

一、实验流程图 


二、实验流程 
(一)质粒转化、涂板、摇菌
1. 取JM109感受态细菌80µl,加入1.5mlEP管中,用10µl枪头沾取质粒加入上述EP管中,混匀。
2. 冰上静置30min。
3. 42℃热休克90-120s1。
4. 迅速移至冰上静置2min。
5. 在超净台内,于上述EP管中加入50µl LB培养基(Amp-),37℃,160rpm摇床,增菌0.5-1h。
6. 菌液4,000rpm离心10min,弃大部分上清,将沉淀重悬,菌液全部加入LB平板(Amp+)上,涂布均匀,37℃倒置培养(过夜12-15h)。
7. 将37℃培养(12-16h)平板取出,于无菌操作台中挑取单克隆放入内含5ml LB培养基(Amp+)的15ml离心管中,于37℃、250rpm摇床增菌过夜18H,看菌液是否浑浊。菌液浑浊后进行质粒中提。
(二)质粒中提
(三)质粒线性化
(四) 琼脂糖凝胶电泳
(五)胶回收
六. 转录以及生物素标记:
1.取无RNA酶管,按下表操作:

1µg线性化DNAxµl
Biotin RNA Labeling mix2µl
10×Transcription buffer2µl
RNA Polymerase2µl
补足RNase-free水至18µl

2. 取出孵育好的EP管,加入2µl的DNaseⅠ,37℃孵育15min以除去体系中的DNA。
3. 取出上述操作的EP管,加入2µl0.2M EDTA(pH=8.0)终止反应。
4. 取1µg Biotin标记的RNA,加入适量Structure Buffer,使得RNA形成二级结构。然后将RNA 95℃加热2min,冰浴3min,室温静置30min。
5. 磁珠准备:使用RIP Wash Buffer 500µl冲洗磁珠3次。
6. 用50µl RIP Wash Buffer重悬磁珠,然后将其加入到生物素标记并变性的RNA中,4℃过夜。
7. 过夜的混合物3000rpm离心1min,去上清。
8. RIP Wash Buffer冲洗3次,切记将液体沿壁加入或者滴加,上下缓慢翻转混匀,切勿用移液器吹打。
9. 往磁珠-RNA混合物中加入细胞裂解液,裂解液中加入适量RNase抑制剂,室温放置1h。
10. 将孵育好的磁珠-RNA-蛋白混合物低速离心,上清回收,使用RIP Wash Buffer冲洗3次,1次1ml。
11. 于样品中加5×SDS上样缓冲液,95℃变性10min,跑SDS-PAGE凝胶。
12. 考染:取出SDS-PAGE凝胶于考马斯亮蓝染色液中,摇床过夜。次日用考马斯亮蓝脱色液脱色1~2h,中间更换几次脱色液至条带清晰,背景低为止。
13. 将目的条带切下送测序 (质谱检测、WB检测)。