FISH原位杂交
栏目:英拜特色服务 发布时间:2018-09-10
RNA原位核酸杂交(RNA nucleic acid hybridization in situ)又称RNA原位杂交......
RNA原位核酸杂交(RNA nucleic acid hybridization in situ)又称RNA原位杂交(RNA in situ hybridization RISH)。该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。其基本原理是:在细胞或组织结构保持不变的条件下,用标记的已知的RNA核苷酸片段,按核酸杂交中碱基配对原则,与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交),所形成的杂交体(Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的RNA分子。现在探针标记技术有生物素、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶和荧光素。
   microRNA原位杂交实验流程:
  • 组织预处理:冰冻切片、石蜡切片、细胞爬片等样本取材、固定、切片。

  • 脱蜡:石蜡切片在乙醇、甲醛中脱蜡。

  • 蛋白k孵育

  • 原位杂交

  • 杂交后处理

  • 杂交后显色


具体实验操作步骤
1、脱蜡:
1)二甲苯脱蜡3次,每次5min;
2)100%酒精两次,每次2min;
3)移出酒精,斜置切片,标记末段向下,空气干燥。
2、蛋白酶处理:
1)每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液,配制方法如下:2×SSC 40ml倒人Facal管,在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内,摇动直到酶溶解。
2) 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。
3) ×SSC在室温下漂洗切片3次,每次1min。
4)梯度酒精脱水(-20℃预冷)。
3、变性:
1)每一个立式染色缸配制40ml变性溶液;
2)78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸;
3)78℃孵育8min;
4) 即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min,再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内,每缸2min;
5)空气干燥。
4、杂交:
1)准备探针;
2)取一个较大的湿盒,交叉放置切片;
3)滴10μl探针在切片的组织上,加盖玻片;
4)盖上湿盒盖,37℃孵育12h~16h。
杂交后的水洗:
5)镊子小心去除盖玻片;
6)43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min;
7)2×SSC(37℃)洗两次,每次10min;
8)切片放人染色缸的1×PBS内待检测,勿使切片干燥。
检测:
9)从1×PBS中取出切片,除去过多的水分,避免标本干燥。把切片放入湿盒内,同时处理4张切片。
10)每张切片使用30μl~60μl罗丹明抗-抗体或FITC卵白素,室温下孵育20min;
11)去掉塑料盖膜,把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次,每次2min。
扩增:
12)从1×PBS中取出切片,斜置切片使液体排出;
13)每张切片滴30μl~60μl抗-卵白素抗体,加塑料盖膜,室温孵育20min;
14)去掉塑料盖膜,把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次,每次2min;
15)从1×PBS中取出切片,斜置切片使液体排出;
16)每张切片滴30μl~60μl抗-卵白素抗体,加塑料盖膜,室温孵育20min;
17)1×PBS室温下洗3次,每次2min。
5、细胞核染色:
1)张切片加10μl~20μl DAPI,覆盖盖玻片并在室温下孵育2~5ml;
2)尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。


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