睾丸特异性表达lncRNA—THOR在肿瘤中的功能研究
睾丸特异性表达lncRNA—THOR在肿瘤中的功能研究
大规模的转录组测序结果已经广泛展示了拥有不同保守性、系谱表达和肿瘤特异性的lncRNAs的种类。有研究人员发现了一种新的超级保守的lncRNA—THOR(ENSG00000226856)，其在睾丸以及很多的肿瘤中广泛表达，并以“Oncogenic Role of THOR, a Conserved Cancer/Testis Long Non-coding RNA”为题，发表在Cell（IF=30.41）上。研究发现在多种细胞系和动物模型中敲除或过表达THOR，能影响细胞或肿瘤的生长。作者同时发现THOR和IGF2BP1存在保守的互作关系，THOR促进IGF2BP1 mRNA的稳定性。敲除THOR使石斑鱼产生生殖缺陷，并抗黑色素瘤形成。相似地，在石斑鱼中过表达人的THOR基因，能加速黑色素瘤的形成。THOR代表了一类新的具有功能的重要肿瘤lncRNAs，这类lncRNAs的结构和功能是经过正向的进化筛选而形成。
文章亮点：作者发现了一种新的超级保守的lncRNA—THOR，其在睾丸中特异性表达，体外和体内实验研究了其在肿瘤发生过程中的重要作用。
研究路线：
研究结果：
图1 THOR是一个保守的睾丸lncRNA。A.基因间区碱基转录本保守水平（X轴）和最保守的200bp滑动窗口中平均保守性（Y轴）的散点图。绿色的点是指在200bp的转录本窗口中达到超级保守区域的标准的转录本。B.在图A中鉴定的超级保守的lncRNAs的保守的碱基比例（X轴上部，绿色）和在RNA-Seq样本中表达（X轴下部，蓝色）C.RNA-Seq数据集GTEx正常组织中THOR的FPKM表达值。D.THOR在基因组上的展示，以及其在小鼠和石斑鱼中的保守同源物。
图2 THOR呈现睾丸特异性表达。A.qRT-PCR检测成年人正常组织中THOR的mRNA表达水平。B.人睾丸的H&E斑放大400倍（右）；人睾丸中THOR的RNA-ISH（左）。C.qRT-PCR检测成年鼠组织（左）和胚胎（右）中THOR的表达水平。D. qRT-PCR检测石斑鱼组织（左）和胚胎（右）中THOR的表达水平。
图3 THOR在肿瘤和可能的肿瘤发生组织中表达。A.来源于GTEx和TCGA数据库的TCGA肿瘤和正常组织样本中THOR的表达。B.CCLE细胞系中THOR的表达。C.TCGA数据库中肺腺癌（LUAD）和肺鳞状细胞癌（LUSC）样本及其相对应的正常组织样本中THOR的表达。D. qRT-PCR验证LUAD中的一个独立组织以及黑色素瘤组织中THOR的表达。E.两个皮肤黑色素瘤（SKCM）和两个非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系中THOR的表达水平。F.2个独立的THOR siRNAs处理之后，NCI-H1299细胞的细胞增殖情况。G. 2个独立的THOR ASOs处理之后，NCI-H1299细胞的细胞增殖情况。H.转染非靶向siRNA（si-NT）或两个siRNAs（siTHOR-A，siTHOR-B）后H1299细胞的生长情况。左图：克隆的数目；右图：代表性的存活克隆和单个克隆的图像。I.LacZ和THOR分别过表达的情况下，CRISPR-Cas9介导的THOR敲除后的NCI-H1299细胞与对照的细胞增殖情况。J.THOR敲除后的NCI-H1299细胞系移植实验显示：与对照样本相比，肿瘤生长减慢。K.稳定转染THOR过表达载体或LacZ对照载体的NCI-H1437细胞的细胞增殖情况。H. LacZ或THOR过表达的H1437细胞的生长情况。M.THOR过表达的NCI-H1437细胞系移植实验显示：与对照样本相比，肿瘤生长加快。
图4 THOR和IGF2BP1保守的互作关系。A.4种不同的实验条件下RNA pull-down结果：人H1299细胞溶解物中加入石斑鱼THOR标为绿色；人H1299细胞溶解物中加入人THOR标为蓝色；石斑鱼胚胎溶解物中加入石斑鱼THOR标为黄色；石斑鱼胚胎溶解物加入人THOR标为红色。C.H1299细胞中IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、STAU1、YBX1、HUR和IgG RIP后，再qRT-PCR验证。D.体外RNA-蛋白结合实验。纯化的myc-标记的蛋白中加入转录后的THOR，qRT-PCR检测显示抗myc pull-down作用。E.人THOR、antisense-THOR（AS）及不同的缺失构建的示意图展示（左图）。片段大小由PCR确认（右图，上）；BRU标记的RNA片段的pull-down检测每一片段结合到IGF2BP1上的情况（右图，下）。F.石斑鱼THOR构建的示意图展示（左图）。片段大小由PCR确认（右图，上）；BRU标记的RNA片段的pull-down检测每一片段结合到石斑鱼igf2bp1上的情况（右图，下）。
图5 在H1299细胞中敲除THOR、IGF2BP1或HUR后，显著差异表达的基因热图。B. 敲除THOR、IGF2BP1或HUR后，细胞中显著差异表达的基因的交集情况韦恩图展示。
图6 THOR调控石斑鱼黑色素瘤的形成。A.THOR敲除的石斑鱼模型的构建流程图。B.来源于野生型的石斑鱼或THOR敲除的石斑鱼的受精胚胎的比率。C.野生型雌性石斑鱼和THOR敲除的雄性石斑鱼交配产生的受精胚胎以及THOR敲除的雌性石斑鱼和野生型雄性石斑鱼交配产生的受精胚胎的比率。D.睾丸状体细胞及6种睾丸状生殖细胞中THOR的表达水平。E.qRT-PCR检测石斑鱼胚胎中12种典型的IGF2BP1靶基因同源基因的表达情况。F.THOR敲除或野生型石斑鱼注射NRAS 61K（可使石斑鱼黑色素瘤的形成可视化）后的KM曲线图。G.THOR过表达的黑色素瘤石斑鱼模型传代示意图。H.注射p53-/-，再共注射促进THOR的启动子或促进对照的启动子的石斑鱼的KM曲线图。I.注射mCherry或THOR，同时注射促进NRAS 61K的启动子后，黑色素瘤占体表面积的百分数。J.共注射促进THOR的启动子或促进对照mCherry的启动子和p53-/-后，NRAS 61K促进石斑鱼黑色素瘤形成的样例。
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