p53突变型肿瘤通过外泌体miR-1246将巨噬细胞重编程为支持肿瘤生长的巨噬细胞
Mutant p53 cancers reprogram macrophages to tumor supporting macrophages via exosomal miR-1246
p53突变型肿瘤通过外泌体miR-1246将巨噬细胞重编程为支持肿瘤生长的巨噬细胞
TP53突变体（mutp53）参与大多数人类癌症的发病进程。特定的mutp53蛋白获得与野生型蛋白的肿瘤抑制活性不同的致癌功能。肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages, TAMs）是实体瘤的标志，通常与不良预后相关。来自美国国立卫生研究院的Curtis C. Harris团队近期在《Nature communications》（IF=12.124）上发表论文报告了人类mutp53癌细胞将巨噬细胞重编程为肿瘤支持性和抗炎状态巨噬细胞的非细胞自主机制。携带致癌活性mutp53的结肠癌细胞选择性地释放富含miR-1246的外泌体。相邻巨噬细胞摄取这些外泌体后触发miR-1246依赖的重编程将巨噬细胞转化为癌症促进状态的巨噬细胞。Mutp53重编程 TAMs有利于抗炎免疫抑制且TGF-β活性增加。这些研究结果提示mutp53在参与免疫系统促进癌症进展和转移微环境中发挥致癌作用。
研究结果
携带mutp53的肿瘤细胞将巨噬细胞重编程
图1 携带mutp53的癌细胞对巨噬细胞发挥非细胞自主作用。a. 人原代单核细胞分别在3种不同巨噬细胞谱系(M0, M1及M2)及具有不同p53突变状态的HCT116细胞中进行生长和分化; b. 人原代单核细胞如a中培养并与含mutp53的HT29共培养; c. 共培养的巨噬细胞接种于cy-3-明胶覆盖的载玻片上48小时，并检测明胶降解速率; d. 共培养细胞采用CD163和CD206荧光抗体染色并通过流式细胞仪分析; e. 共培养的巨噬细胞接种在玻片并与荧光酵母聚糖颗粒孵育24小时后检测酵母聚糖吞噬作用；f. g. 共培养的巨噬细胞收集后通过电阻抗重新接种，5天后检测迁移(f)和侵袭(g).
mutp53肿瘤细胞释放的外泌体携带特异性的miRNA标签
2. 肿瘤细胞释放的外泌体被相邻巨噬细胞摄取. a. 从含野生型、突变型或敲除型p53的HCT116细胞中分离外泌体并通过Western blot鉴定；b.外泌体粒径检测；c. 外泌体浓度检测；d. 在与巨噬细胞孵育24或48小时前，使用syto RNA标记外泌体，采用延时电影捕获外泌体摄取积累。e. 外泌体提取RNA，并检测RNA完整性及质量，并归一化为丰度最高的100个miRNAs. f. mutp53型HT29细胞与对照相比变化倍数超过2倍的miRNAs. g. 4种主要miRNAs的变化倍数.
外泌体miR-1246与肿瘤细胞及肿瘤相关巨噬细胞中的mutp53相关
3 mutp53肿瘤细胞释放的外泌体携带特定的miRNA. a.巨噬细胞与HCT116细胞共培养，检测miR-1246; b. 巨噬细胞与含不同p53突变状态的HCT116细胞分离的外泌体(10μg)共培养，检测miR-1246, miR-21及miR-4454; c. M1及M2型巨噬细胞转染LNA-miR-1246 mimic或对照后检测TNF-α 和 IL-10. d. HCT116 mutp53细胞转染miR-1246 mimic，miR-1246 inhibitor或对照. 48小时后，与M2巨噬细胞共培养3天并检测TNF-α, CCL2及IL-10. e. HCT116 mutp53细胞分离外泌体并通过不同尺寸柱子分离游离蛋白。巨噬细胞与外泌体(exos)或游离蛋白(Prot)孵育并检测相关基因表达量; f. M2巨噬细胞与不同状态p53的HCT116外泌体共培养不同时间后检测pre-miR-1246.
Mutp53触发miR-1246依赖性的巨噬细胞重编程
4. miR-1246与mutp53相关且在重编程肿瘤相关巨噬细胞中发挥作用. a.b. M2巨噬细胞与mutp53或野生型p53 HCT116细胞共培养6天，将重编程巨噬细胞与HCT116野生型细胞混匀后接种到NOD-SCID小鼠上，每周观测肿瘤大小. c.d. 在第56天，处死小鼠，取出肝和肺检测转移灶；e.f. M2巨噬细胞转染miR-1246 mimic 及空载，3天后，将巨噬细胞与荧光标记的HCT116细胞混合并皮下注射到NOD-SCID小鼠后背.
5. Mutp53与结直肠癌患者肿瘤相关巨噬细胞呈正相关
5 Mutp53与结直肠癌患者的肿瘤相关巨噬细胞正相关. a.b. 与携带野生型p53的结直肠癌患者相比，携带mutp53人结直肠癌患者的癌腺体上皮细胞中p53呈强阳性免疫染色且与周围基质细胞中CD163和CD206呈相关性. c.d. 与野生型p53病例相比，携带mutp53结直肠癌患者的侵袭前沿中呈现弥散且强烈的CD206免疫阳性. e. mRNA表达谱分析. f. 携带不同p53的结直肠癌患者的生存曲线分析.
6. Mutp53与结直肠癌患者的miR-1246正相关
6 Mutp53与结直肠癌患者miR-1246呈相关性. a. 27例野生型p53的结直肠癌患者和28例mutp53患者的miRNA芯片. b. 与野生型P53病例相比，携带mutp53患者的上皮细胞和基质细胞呈miR-1246强阳性染色. d. 结直肠癌患者外泌体miRNA检测.
7. 结直肠癌患者TGF-β信号通路和免疫抑制
7 携带mutp53的结直肠癌患者TGF-β信号通路和免疫抑制增加. a.b. 与野生型p53结肠癌患者相比，携带mutp53的结直肠癌患者呈现p53强阳性上皮细胞染色，且与FOXP3非上皮细胞免疫染色相关. c.d. GSEA分析p53获得性突变结肠癌细胞与其他突变类型结肠癌细胞的炎性基因集合与TGF-β信号通路基因集合. e. 假说图.
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