来自人类尿液干细胞的外泌体的DMBT1通过促进血管的生成加速糖尿病创伤修复
来自人类尿液干细胞的外泌体的DMBT1通过促进血管的生成加速糖尿病创伤修复
慢性非治愈性伤口是糖尿病最常见的并发症之一，需要先进的治疗策略。外泌体是细胞旁分泌作用的关键介质，可以直接作为组织修复和再生的治疗剂。在2018年2月7日发表于期刊《Theranostics》(IF=8.766)的《Exosomal DMBT1 from human urine-derived stem cells facilitates diabetic wound repair by promoting Angiogenesis》中，作者探讨了人类尿源性干细胞（USC-Exos）对糖尿病伤口愈合的作用和机制。
用流式细胞仪和多向分化潜能分析描述USCs的特点。USCs-Exos从USCs的条件培养基中分离，并通过透射电镜和流式细胞仪鉴定。然后作者进行了一系列功能分析去评估USC-Exos对创面愈合相关细胞活性的影响。另外，作者通过蛋白质组学分析检测了USC- Exos和USCs的蛋白图谱差异，筛选出USC- Exos和USCs显著差异蛋白。USC- Exos在STZ诱导的糖尿病小鼠伤口愈合的影响通过测量伤口闭合率、组织学和免疫荧光分析进行检测。同时，评估了候选蛋白在USC-Exos诱导的内皮细胞血管生成活性调节和糖尿病伤口愈合中的作用。
研究发现USCs 呈CD29、CD44，CD73和CD90阳性，同时呈现CD34和CD45阴性。USCs能够分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。USC- Exos呈现出杯形或平均直径为51.57±2.93 nm的球形外观，且CD63和TSG101呈阳性。USC- Exos可以增强伤口愈合相关细胞的功能特性包括内皮细胞生成血管的活性。USC -Exos富含参与伤口愈合相关生物学过程的蛋白质。特别是促血管生成蛋白DMBT1在USC -Exos中高度表达。进一步的功能实验表明，DMBT1蛋白是USC-Exos诱导的促内皮细胞血管生成应答以及糖尿病小鼠中的血管生成和伤口愈合所需的。作者的研究成果表明，USC-Exos可能通过转移DMBT1蛋白促进血管生成，这可能成为糖尿病组织创伤愈合的有前途的治疗策略。
技术路线：
实验结果
1.USC和USC-Exos分离与鉴定
图1. USC和USC-Exos的鉴定。（A）USCs显示出纺锤状的形态。通过茜素红S染色（B-a），油红O染色（B-b）和阿尔新蓝染色（B-c）证明，USCs能够分化成成骨细胞，脂肪细胞或软骨细胞。（C）流式细胞术分析USCs上的细胞表面标记。（D）透射电子显微镜下USC-Exos的形态学。（E）外泌体直径分布。（F）流式细胞仪鉴定USC-Exos。
2.USC-Exos促进角质细胞和成纤维细胞的增殖迁移
图2. USC-Exos增强角质形成细胞和成纤维细胞的增殖迁移。（A）PKH67标记的荧光显微镜分析人类角质形成细胞HaCaT和皮肤成纤维细胞 （HSFs）的USC-Exos内化作用。（B）通过CCK-8分析检测接受不同处理下的HaCaT和HSF的细胞增殖情况。（C）（D）用USC-Exos或PBS处理的HaCaT中划痕实验；（E）（F）通过transwell测定检测由USC-Exos或等体积的PBS孵育的HSF的迁移。
3.USC-Exos增强内皮细胞生成血管的活性
图3. USC-Exos增强内皮细胞生成血管的活性。（A）荧光显微镜分析显示USC-Exos被人类微血管内皮细胞（HMECs）摄取。（B）（C）小管形成实验检测USC-Exos或PBS处理的HMEC。（D）CCK-8分析结果显示，USC-Exos孵育HMEC后，细胞增殖能力增强。（E-H）Transwell分析和划痕伤口愈合测定显示USC-Exos孵育增强了HMEC的迁移和侵袭能力。
4.USC和USC-Exos的蛋白质组学分析
图4. USC和USC-Exos孵育组的蛋白质组学分析。(A)GO功能富集显示差异表达蛋白参与一系列伤口愈合相关的生物学过程。 (B）与USC孵育组相比，USC-Exos组中血管生成相关蛋白和外泌体标志物的表达情况。（C）Western blot实验验证USC-Exos和USCs中的DMBT1，VEGF-A和一系列外泌体标记蛋白的表达情况。
5.DMBT1介导USC-Exos在内皮细胞上促血管生成的作用
图5. DMBT1介导的USC-Exos在内皮细胞上促血管生成作用。（A）通过qRT-PCR分析进行靶向DMBT1的shRNA抑制效率的验证。（B）用Western印迹法验证USCsshDMBT1 #1-Exos和USCsCon shRNA-Exos。（C）通过CCK-8分析测试经过不同处理的HMEC的增殖。（D-G）通过划伤试验检测HMEC的迁移。（H）HMEC中的管形成测定的代表性图像。（I-K）定量分析总管（H）中的长度，总分支点和总循环。（L）通过western印迹处理检测HMECs中VEGF-A，Akt和p-Akt蛋白水平的变化。
6.外泌体的DMBT1加速糖尿病小鼠皮肤伤口的愈合
图6.外泌体DMBT1加速糖尿病小鼠的皮肤伤口愈合。（A）用PBS处理的伤口的总视图。（B）接受不同治疗的伤口闭合率。（C）伤口切片的H＆E染色。（D）（C）中瘢痕宽度的定量分析和上皮再生的程度。（E）伤口切片的Masson三色染色。（F）（E）中Masson染色区域的平均强度的定量分析。（G）伤口切片染色的ki67的代表性图像。（H）在（F）中ki67阳性细胞数量的定量研究。
7.外泌体的DMBT1促进糖尿病小鼠伤口部位的血管生成
图7。外泌体DMBT1促进糖尿病小鼠创面血管生成。（A）用PBS，USCsCon处理的伤口的总视图。在伤口处发现新形成的血管。（B）伤口切片的CD31免疫荧光染色。（C）（B）中血管密度的定量分析。