YTHDF1/RNF7/p27轴促进前列腺癌进展

         前列腺癌（PCa）是泌尿系统常见的恶性肿瘤，是男性最常见的癌症。在本研究中，我们证明了YTHDF1在PCa癌组织和细胞中高表达，与较差的临床结果相关。YTHDF1敲除通过蛋白酶体降解信号减少p27蛋白稳定性，从而抑制肿瘤细胞增殖、迁移和异种移植肿瘤形成。一致地，YTHDF1耗尽显著减少了Pten或/和TP53缺陷类器官的克隆生长。RNF7是YTHDF1的直接下游靶点。RNF7的高翻译导致细胞周期抑制剂p27的有效降解和恶性肿瘤细胞增长。此外，我们提供了证据表明YTHDF1或RNF7耗尽通过增加细胞凋亡使肿瘤细胞对化疗药物顺铂敏感。我们的研究结果揭示了neddylation抑制剂MLN4924在体外和体内有效抑制前列腺癌进展。我们的研究强调了YTHDF1/RNF7/p27轴是PCa的一个关键组成部分，表明其作为新治疗靶点的潜力。本文于2025年4月发表于“Cell Death and Disease”（IF=8.1）上。

技术路线：

结果：

1）YTHDF1在前列腺癌细胞中高表达

         通过对TCGA数据库的全面分析，我们观察到YTHDF1在各种肿瘤类型中高表达，包括前列腺癌（图1A）。随后的分析显示，与对照（邻近或癌旁）组织相比，前列腺癌组织中YTHDF1的表达显著升高（图1B，C）。此外，YTHDF1的升高表达与患者较差的预后显著正相关（图1D）。ROC曲线分析显示，YTHDF1的AUC值为0.749，表明其作为前列腺癌独立生物标志物的潜力（图1E）。此外，YTHDF1与前列腺癌的分期相关（图1F，G）。同时，我们的组织微阵列分析显示，YTHDF1在前列腺癌组织中显著过表达（图1H，I）。我们的研究结果表明，与正常前列腺细胞RWPE-1相比，YTHDF1在前列腺癌细胞系PC3，DU145，22RV-1和LNCaP中显著过表达（图1J，K）。我们在DU145和22RV-1中创建了YTHDF1敲低细胞系，证明YTHDF1敲低显著减少了肿瘤细胞增殖（图1L–P）。

2）YTHDF1调控肿瘤细胞周期转变

         鉴于YTHDF1促进前列腺癌细胞增殖，我们发现通过BrdU掺入实验（图2A，B）沉默YTHDF1有效地破坏了细胞周期转换。流式细胞术分析表明，YTHDF1敲低导致细胞周期在G0/G1期停滞（图2C）。检测参与G0/G1期细胞周期转换的关键调控因子，发现p27蛋白显著上调，而CDK2、CDK4和CDK6蛋白没有显著变化（图2D）。此外，我们在人正常前列腺RWPE-1细胞中过表达YTHDF1，并评估其潜在的致癌效应，结果表明YTHDF1强制表达增强了细胞增殖（图2E–I）。在体外证实YTHDF1促进肿瘤细胞增殖后，我们评估了其在体内的效应。最初，我们利用小鼠前列腺癌类器官，研究结果显示敲低小鼠YTHDF1显著减少了Pten-或/和TP53缺陷类器官的克隆形成（图2J–M）。同时，在裸鼠中进行异种移植肿瘤形成的实验表明，YTHDF1敲低显著延缓了体内肿瘤生长（图2N）。异种移植肿瘤表型进一步通过YTHDF1敲低后肿瘤体积的减少得到证实（图2O），并通过IHC染色确定Ki67染色阳性率显著降低（图2P–Q）。

3）YTHDF1提高了RNF7转录物的翻译效率

         为了进一步阐明p27的上调是否是YTHDF1敲低后抑制肿瘤细胞增殖的关键因素，我们在YTHDF1敲低的指示细胞中进行了p27的进一步敲低，并发现p27敲低抵消了YTHDF1的效果（图3A–B）。值得注意的是，YTHDF1敲低后p27的RNA水平没有显著变化。考虑到YTHDF1不与p27转录本结合，我们假设YTHDF1通过其他介质在转录后水平减少p27蛋白表达。因此，将放线菌酮（CHX）引入细胞中，结果显示YTHDF1敲低组中p27蛋白的稳定性显著增强（图3C）。此外，我们发现只有蛋白酶体降解信号抑制剂MG132，而不是溶酶体抑制剂CQ（氯喹），能够逆转YTHDF1过表达和敲低细胞中p27蛋白的减少，这表明YTHDF1通过增强p27蛋白的泛素降解来促进细胞周期进程（图3D）。因此，我们评估了前列腺癌细胞中p27的泛素化状态，并观察到YTHDF1敲低后其泛素化水平显著降低（图3E）。我们分析了已知靶向p27的E3泛素连接酶的表达，如CUL1、SKP1和SKP2。在YTHDF1敲低的肿瘤细胞中，只有RNF7，是E3泛素连接酶RBX/ROC RING的一个关键亚单位，对癌细胞生长至关重要，与对照细胞相比显著减少。同时，CUL1、SKP1和SKP2的水平保持不变（图3F），而RNF7的mRNA几乎没有变化。重要的是，我们使用m6A Atlas数据集预测了RNF7 mRNA上的三个候选m6A修饰位点，随后通过m6A-RIP和YTHDF1-RIP实验进行了验证（图3G–I）。多核糖体分析进一步证实，沉默YTHDF1降低了RNF7的翻译效率（图3J–K）。异种移植肿瘤组织的IHC染色显示，与对照相比，YTHDF1敲低组中RNF7水平降低，p27水平升高（图3L–M）。总之，这些发现证实了YTHDF1在提高RNF7翻译效率中的作用，从而促进泛素介导的p27蛋白降解，并导致肿瘤的生长。

4）RNF7在前列腺癌中起致癌基因的作用

         为了验证YTHDF1/RNF7/p27轴在前列腺癌中的关键作用，我们首先评估了前列腺癌组织微阵列中RNF7的表达，并观察到RNF7和YTHDF1蛋白之间存在正相关，同时未检测到RNF7 mRNA的显著变化（图4A–C）。与RWPE-1相比，RNF7蛋白水平在前列腺癌细胞系中升高（图4D）。与YTHDF1的研究结果一致，高RNF7表达的患者与较差的预后相关（图4E）。然而，YTHDF1和RNF7联合分析的AUC值为0.757，与RNF7单独分析的AUC值0.582相比有显著增加。同时，与YTHDF1的AUC值0.749相比没有显著改善，这进一步表明YTHDF1可能参与RNF7蛋白的翻译过程（图1E，4F–G）。我们在前列腺癌细胞中进一步进行了RNF7敲低，并观察到肿瘤细胞增殖显著抑制（图4H–L）。如预期的那样，我们在前列腺癌细胞系中过表达RNF7并结合YTHDF1敲低，这抵消了YTHDF1敲低对肿瘤细胞增殖的抑制作用（图4M–P）。

5）YTHDF1敲低可促进肿瘤细胞对化疗的敏感性

         为了探索YTHDF1在前列腺癌中的临床应用，我们决定研究抑制YTHDF1是否能增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。一线化疗药物顺铂（DDP）的抗肿瘤作用的主要分子机制涉及DNA损伤诱导的ROS依赖性细胞凋亡。如预期的那样，在YTHDF1敲低后进行DDP处理显著降低了肿瘤细胞的活力（图5A）。流式细胞术分析证实，敲低YTHDF1显著增加了细胞凋亡（图5B–C），证据是在DDP处理后增加了cleaved PARP和cleaved caspase3，而过表达RNF7可以恢复cleaved PARP和cleaved caspase3的水平（图5D）。YTHDF1耗尽显著提高了DDP处理诱导的细胞内ROS水平，随后被RNF7过表达降低（图5E–G）。一致地，我们在RNF7敲低细胞中观察到DDP处理的类似协同效应（图5H–I）。上述发现通过体内异种移植肿瘤模型得到验证，我们展示了YTHDF1敲低在DDP处理后延缓了肿瘤生长（图5J–L）。IHC染色显示，与对照相比，YTHDF1敲低组中CC3显著增加，Ki67显著减少（图5M–N）。

6）RNF7可作为前列腺癌的潜在治疗靶点

         为了研究抑制RNF7是否具有与YTHDF1类似的临床应用潜力，我们使用了MLN4924，这是一种NAE的小分子抑制剂，通过阻断cullin neddylation来使RNF7失活。我们发现MLN4924显著降低了肿瘤细胞的活力（图6A–C）。与之前的结果一致，将MLN4924添加到肿瘤细胞中显著抑制了肿瘤细胞增殖，并以泛素化依赖的方式增强了p27蛋白的稳定性，且这种效应在浓度和时间梯度上均存在（图6D–F）。此外，MLN4924与DDP处理联合使用显著增加了细胞凋亡（图6G–J）。此外，异种移植肿瘤形成实验验证了MLN4924给药抑制了肿瘤生长并增强了肿瘤细胞对DDP的敏感性（图6K–N）。总之，上述数据表明MLN4924未来可以进一步开发用于治疗前列腺癌患者。

结论：

         YTHDF1/RNF7/p27轴促进前列腺癌进展，为前列腺癌的治疗提供了新的治疗靶点。

实验方法：

         RIP，多聚核糖体分析，qRT-PCR，IHC，异种移植肿瘤模型。

参考文献：

         Shi Y, Liu B, Zhang Y, Zhao S, Zuo L, Pu J, Zhai H, Mu D, Du J, Cheng Y, Yang C, Chen Y. YTHDF1/RNF7/p27 axis promotes prostate cancer progression. Cell Death Dis. 2025 Apr 18;16(1):314. doi: 10.1038/s41419-025-07648-3.